Differenza chiave – Sequenziamento NGS vs Sanger
Next Generation Sequencing (NGS) e Sanger Sequencing sono due tipi di tecniche di sequenziamento nucleotidico sviluppate nel tempo. Il metodo di sequenziamento Sanger è stato ampiamente utilizzato per molti anni e NGS lo ha sostituito di recente per i suoi vantaggi. La differenza chiave tra NGS e Sanger Sequencing è che NGS funziona sul principio di sequenziare milioni di sequenze simultaneamente in modo rapido attraverso un sistema di sequenziamento mentre il Sanger Sequencing lavora sul principio della terminazione della catena a causa dell'incorporazione selettiva di dideossinucleotidi da parte dell'enzima DNA polimerasi durante la replicazione del DNA e la conseguente separazione dei frammenti mediante elettroforesi capillare.
Cos'è il sequenziamento nucleotidico?
Le informazioni genetiche sono immagazzinate nelle sequenze nucleotidiche del DNA o dell'RNA di un organismo. Il processo di determinazione dell'ordine corretto dei nucleotidi (usando quattro basi) in un dato frammento (in un gene, cluster di geni, cromosoma e genoma completo) è noto come sequenziamento nucleotidico. È molto importante negli studi genomici, negli studi forensi, nella virologia, nella sistematica biologica, nella diagnosi medica, nella biotecnologia e in molti altri campi per analizzare la struttura e la funzione dei geni. Esistono diversi tipi di metodi di sequenziamento sviluppati dagli scienziati. Tra questi, il sequenziamento Sanger sviluppato da Frederick Sanger nel 1977 è stato ampiamente utilizzato e reso popolare per un lungo periodo fino a quando il sequenziamento di nuova generazione non lo ha sostituito.
Cos'è NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) è un termine usato per riferirsi ai moderni processi di sequenziamento ad alto rendimento. Descrive una serie di diverse moderne tecnologie di sequenziamento che hanno rivoluzionato gli studi genomici e la biologia molecolare. Queste tecniche sono il sequenziamento Illumina, il sequenziamento Roche 454, il sequenziamento Ion Proton e il sequenziamento SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). I sistemi NGS sono più veloci ed economici. Quattro principali metodi di sequenziamento del DNA sono utilizzati nei sistemi NGS, vale a dire; pyrosequencing, sequenziamento per sintesi, sequenziamento per legatura e sequenziamento di semiconduttori ionici. Un gran numero di filamenti di DNA o RNA (milioni di) possono essere sequenziati in parallelo. Consente il sequenziamento dell'intero genoma degli organismi in un breve periodo di tempo, a differenza del sequenziamento di Sanger che richiede più tempo.
NGS ha molti vantaggi rispetto al metodo Sanger di sequenziamento convenzionale. È un processo ad alta velocità, più accurato ed economico che può essere eseguito con una piccola dimensione del campione. L'NGS può essere utilizzato negli studi metagenomici, nel rilevamento di variazioni all'interno di un genoma individuale dovute a inserzioni e delezioni ecc. e nell'analisi delle espressioni geniche.
Figura_1: Sviluppi nel sequenziamento NGS
Cos'è il sequenziamento di Sanger?
Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi colleghi nel 1977 per determinare il preciso ordine nucleotidico di un dato frammento di DNA. È anche noto come sequenziamento di terminazione di catena o sequenziamento di dideossi. Il principio di funzionamento di questo metodo è l'interruzione della sintesi del filamento mediante incorporazione selettiva di dideossinucleotidi a terminazione di catena (ddNTP) come ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP da parte della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA. I nucleotidi normali hanno gruppi 3'OH per la formazione di un legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti per continuare la formazione del filamento. Tuttavia, i ddNTP mancano di questo gruppo 3 'OH e non sono in grado di formare legami fosfodiestere tra i nucleotidi. Quindi, l'allungamento della catena è cessato.
In questo metodo, il DNA a filamento singolo da sequenziare funge da filamento modello per la sintesi del DNA in vitro. Altri requisiti sono il primer oligonucleotidico, i precursori deossinucleotidici e l'enzima DNA polimerasi. Quando le estremità fiancheggianti del frammento bersaglio sono note, i primer possono essere facilmente progettati per la replicazione del DNA. Quattro reazioni di sintesi del DNA separate vengono eseguite in quattro provette separate. Ogni tubo ha ddNTP separati, insieme ad altri requisiti. Dal particolare nucleotide viene aggiunta una miscela di dNTP e ddNTP. Allo stesso modo, vengono eseguite quattro reazioni separate in quattro provette con quattro miscele. Dopo le reazioni, viene eseguita la rilevazione dei frammenti di DNA e la conversione del pattern del frammento in informazioni di sequenza. I frammenti di DNA risultanti vengono denaturati termicamente e separati mediante elettroforesi su gel. Se vengono utilizzati nucleotidi radioattivi, il pattern di banding nel gel di poliacrilammide può essere visualizzato mediante autoradiografia. Quando questo metodo utilizza i dideossinucleotidi contrassegnati in modo fluorescente, può essere mitigato lungo il gel letto e fatto passare attraverso un raggio laser per essere rilevato dal rivelatore fluorescente. Per evitare errori che potrebbero verificarsi quando una sequenza viene letta dall'occhio e inserita manualmente in un computer, questo metodo si è sviluppato nell'uso di un sequencer automatizzato accoppiato al computer.
Questo è il metodo utilizzato per sequenziare il DNA dal progetto Human Genome. Questo metodo è ancora in uso con modifiche avanzate perché fornisce informazioni accurate sulla sequenza nonostante sia un processo lento e costoso.
Figura_2: Sequenziamento di Sanger
Qual è la differenza tra NGS e Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
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| Next Generation Sequencing (NGS) si riferisce ai moderni processi di sequenziamento ad alto rendimento. Descrive una serie di diverse moderne tecnologie di sequenziamento | Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger per determinare il preciso ordine nucleotidico di un dato frammento di DNA. |
| Efficacia dei costi | |
| NGS è un processo più economico perché riduce il tempo, la manodopera e le sostanze chimiche. | Questo è un processo costoso perché richiede tempo, manodopera e più sostanze chimiche. |
| Velocità | |
| Questo è più veloce poiché sia il rilevamento chimico che il rilevamento del segnale di molti filamenti avvengono parallelamente. | Questo richiede molto tempo poiché il rilevamento di sostanze chimiche e il rilevamento del segnale avviene come due processi separati e solo sul filo possono essere letti alla volta. |
| Affidabilità | |
| NGS è affidabile. | Il sequenziamento di Sanger è meno affidabile |
| Dimensione del campione | |
| NGS richiede meno quantità di DNA. | Questo metodo richiede una grande quantità di DNA modello. |
| Basi di DNA per frammento sequenziato | |
| Il numero di basi di DNA per frammento sequenziato è inferiore al metodo Sanger | Le sequenze di generazione sono più lunghe delle sequenze NGS. |
Riepilogo – Sequenziamento NGS vs Sanger
NGS e Sanger Sequencing sono tecniche di sequenziamento nucleotidico ampiamente utilizzate in biologia molecolare. Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento iniziale che è stato sostituito da NGS. La principale differenza tra NGS e Sanger Sequencing è che NGS è un processo ad alta velocità, più accurato ed economico rispetto al sequenziamento Sanger. Entrambe le tecniche hanno creato importanti focolai in genetica e biotecnologia.
