Differenza chiave – Sequenziamento Sanger vs Pyrosequencing
Il sequenziamento del DNA è molto importante per l'analisi del DNA poiché la conoscenza della corretta disposizione dei nucleotidi su una particolare regione del DNA rivela molte informazioni importanti su di essa. Esistono diversi metodi di sequenziamento del DNA. Il sequenziamento di Sanger e il Pyrosequencing sono due diversi metodi di sequenziamento del DNA ampiamente utilizzati in biologia molecolare. Il differenza fondamentale tra il sequenziamento di Sanger e il pirosequenziamento è quello Il sequenziamento di Sanger utilizza dideossinucleotidi per terminare la sintesi del DNA per leggere la sequenza nucleotidica mentre il pirosequenziamento rileva il rilascio di pirofosfato incorporando i nucleotidi e sintetizzando la sequenza complementare per leggere l'ordine preciso della sequenza.
Cos'è il sequenziamento di Sanger?
Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA di prima generazione sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi college nel 1977. È anche noto come Chain Termination Sequencing o Dideoxy sequencing poiché si basa sulla terminazione della catena da parte dei dideossinucleotidi (ddNTP). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per più di 30 anni fino allo sviluppo del New Generation Sequencing (NGS). La tecnica di sequenziamento di Sanger ha consentito la scoperta dell'ordine nucleotidico corretto o l'attaccamento di un particolare frammento di DNA. Si basa sull'incorporazione selettiva di ddNTP e sull'interruzione della sintesi del DNA durante la replicazione del DNA in vitro. L'assenza di gruppi 3'OH per continuare la formazione del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti è una caratteristica unica dei ddNTP. Quindi, una volta che il ddNTP è attaccato, l'allungamento della catena cessa e termina da quel punto. Ci sono quattro ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP – usati nel sequenziamento di Sanger. Questi nucleotidi bloccano il processo di replicazione del DNA quando vengono incorporati nel filamento di DNA in crescita e danno luogo a lunghezze variabili di DNA corto. L'elettroforesi su gel capillare viene utilizzata per organizzare questi brevi filamenti di DNA in base alle loro dimensioni su un gel, come mostrato nella Figura 01.
Figura 1: Elettroforesi su gel capillare del DNA corto sintetizzato
Per la replicazione in vitro del DNA, dovrebbero essere forniti pochi requisiti. Sono l'enzima DNA polimerasi, il DNA stampo, i primer oligonucleotidici e i deossinucleotidi (dNTP). Nel sequenziamento di Sanger, la replicazione del DNA viene eseguita in quattro provette separate insieme a quattro tipi di ddNTP separatamente. I deossinucleotidi non sono totalmente sostituiti dai rispettivi ddNTP. Una miscela del particolare dNTP (ad esempio; dATP + ddATP) viene inclusa nella provetta e replicata. Quattro prodotti in provetta separati vengono eseguiti su un gel in quattro pozzetti separati. Quindi, leggendo il gel, è possibile costruire la sequenza come mostrato nella Figura 02.
Figura 02: Sequenziamento di Sanger
Il sequenziamento di Sanger è una tecnica importante che aiuta in molte aree della biologia molecolare. Il progetto sul genoma umano è stato completato con successo con l'aiuto dei metodi basati sul sequenziamento di Sanger. Il sequenziamento di Sanger è utile anche nel sequenziamento del DNA target, nella ricerca su cancro e malattie genetiche, nell'analisi dell'espressione genica, nell'identificazione umana, nel rilevamento di agenti patogeni, nel sequenziamento microbico ecc.
Ci sono diversi svantaggi nel sequenziamento di Sanger:
- La lunghezza del DNA sequenziato non può essere maggiore di 1000 coppie di basi
- Può essere sequenziato solo un filo alla volta.
- Il processo richiede tempo e denaro.
Pertanto, nuove tecniche avanzate di sequenziamento sono state sviluppate con il tempo per superare questi problemi. Tuttavia, il sequenziamento Sanger è ancora in uso grazie ai suoi risultati altamente accurati fino a circa 850 frammenti di coppie di basi.
Cos'è il Pyrosequencing?
Pyrosequencing è una nuova tecnica di sequenziamento del DNA basata sul "sequenziamento per sintesi". Questa tecnica si basa sulla rilevazione del rilascio di pirofosfato sull'incorporazione del nucleotide. Il processo è impiegato da quattro diversi enzimi: DNA polimero, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi e due substrati adenosina 5'fosfosolfato (APS) e luciferina.
Il processo inizia con il legame del primer con il modello di DNA a filamento singolo e la DNA polimerasi inizia l'incorporazione di nucleotidi complementari ad esso. Quando i nucleotidi si uniscono (polimerizzazione dell'acido nucleico), rilascia gruppi ed energia di pirofosfato (due gruppi di fosfato legati insieme). Ogni aggiunta di nucleotide rilascia una quantità equimolare di pirofosfato. Il pirofosfato si converte in ATP dalla solforilasi ATP in presenza del substrato APS. L'ATP generato guida la conversione mediata dalla luciferasi della luciferina in ossiluciferina, producendo luce visibile in quantità proporzionali alla quantità di ATP. La luce viene rilevata da un dispositivo di rilevamento di fotoni o da un fotomoltiplicatore e crea un pirogramma. L'apirasi degrada l'ATP e i dNTP non incorporati nella miscela di reazione. L'aggiunta di dNTP viene eseguita una volta alla volta. Poiché l'aggiunta di nucleotide è nota in base all'incorporazione e al rilevamento della luce, è possibile determinare la sequenza del modello. Il pirogramma viene utilizzato per generare la sequenza nucleotidica del DNA campione come mostrato nella Figura 03.
Il pirosequenziamento è molto importante nell'analisi del polimorfismo a singolo nucleotide e nel sequenziamento di brevi tratti di DNA. L'elevata precisione, flessibilità, facilità di automazione ed elaborazione parallela sono i vantaggi del pyrosequencing rispetto alle tecniche di sequenziamento Sanger.
Figura 03: Pirosequenziamento
Qual è la differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
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| Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA basato sull'incorporazione selettiva di ddNTP da parte della DNA polimerasi e dalla terminazione della catena. | Il pyrosequencing è un metodo di sequenziamento del DNA basato sul rilevamento del rilascio di pirofosfato in seguito all'incorporazione del nucleotide. |
| Uso di ddNTP | |
| ddNTPs vengono utilizzati per terminare la replicazione del DNA | ddNTP non vengono utilizzati. |
| Enzimi coinvolti | |
| Viene utilizzata la DNA polimerasi. | Sono utilizzati quattro enzimi: DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi. |
| Substrati utilizzati | |
| APS e Luciferina non vengono utilizzati. | Si utilizzano l'adenosina 5'fosfosolfato (APS) e la luciferina. |
| Temperatura massima | |
| Questo è un processo lento. | Questo è un processo veloce. |
Riepilogo – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Il sequenziamento di Sanger e il Pyrosequencing sono due metodi di sequenziamento del DNA utilizzati in biologia molecolare. Il sequenziamento di Sanger costruisce l'ordine dei nucleotidi in sequenza terminando l'allungamento della catena mentre il pyrosequencing costruisce l'ordine preciso dei nucleotidi in sequenza incorporando i nucleotidi e rilevando il rilascio di pirofosfati. Pertanto, la principale differenza tra il sequenziamento di Sanger e il Pyrosequencing è che il sequenziamento di Sanger funziona sul sequenziamento per terminazione di catena mentre il pirosequenziamento lavora sul sequenziamento per sintesi.
