Differenza chiave: Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
I nucleotidi sono le unità strutturali di base e gli elementi costitutivi del DNA. La molecola del DNA è composta da una catena polinucleotidica. Ci sono quattro diversi nucleotidi trovati nel DNA. Questi nucleotidi sono composti da quattro diverse basi azotate denominate A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina). L'ordine dei nucleotidi nella molecola del DNA ha una grande importanza in quanto codifica un'importante informazione genetica per la crescita e lo sviluppo degli organismi. Il sequenziamento del DNA si riferisce al processo che determina la precisa sequenza nucleotidica del DNA. Esistono diversi metodi di sequenziamento del DNA. Il sequenziamento di Maxam Gilbert e il sequenziamento del DNA di Sanger sono due metodi di sequenziamento del DNA che appartengono al sequenziamento di prima generazione. La procedura di sequenziamento di Maxam Gilbert determina la sequenza di base scindendo chimicamente i frammenti di DNA etichettati con l'estremità 5' preferenzialmente a ciascuno dei quattro nucleotidi e l'elettroforesi su gel. La procedura di sequenziamento di Sanger determina la sequenza nucleotidica sintetizzando il DNA a filamento singolo utilizzando la DNA polimerasi e dideossinucleotidi ed elettroforesi su gel. Questa è la differenza fondamentale tra Maxam Gilbert e Sanger Sequencing.
Cos'è il sequenziamento di Maxam Gilbert?
Il sequenziamento di Maxam Gilbert, noto anche come metodo di sequenziamento chimico, è una tecnica sviluppata per determinare l'ordine dei nucleotidi nel DNA. Questo metodo è stato introdotto da W alter Gilbert e Alan Maxam nel 1976 ed è diventato popolare poiché può essere eseguito direttamente con DNA purificato. Il metodo Maxam Gilbert appartiene alla prima generazione di sequenziamento del DNA ed è stato il primo metodo di sequenziamento ampiamente utilizzato dagli scienziati.
Il principio di base di questo metodo risiede nella restrizione dei frammenti di DNA etichettati all'estremità su basi specifiche mediante sostanze chimiche e condizioni specifiche della base e separazione dei frammenti marcati mediante elettroforesi come mostrato nella figura 01. I frammenti sono separati secondo alle loro dimensioni sul gel. Poiché i frammenti sono etichettati, la sequenza della molecola di DNA può essere facilmente dedotta.
Il metodo Maxam gilbert utilizza sostanze chimiche specifiche per base per rompere il DNA in basi specifiche. Due comuni sostanze chimiche denominate dimetilsolfato e idrazina vengono utilizzate per attaccare selettivamente le purine e le pirimidine, rispettivamente.
Il metodo di sequenziamento di Maxam Gilbert viene eseguito attraverso diversi passaggi come segue.
- Purificazione della sequenza del DNA mediante endonucleasi di restrizione
- Etichettatura delle estremità dei frammenti di DNA mediante aggiunta di fosfati radioattivi
- Purificazione dei frammenti marcati da frammenti non marcati mediante elettroforesi su gel
- Separazione del DNA marcato all'estremità in quattro provette e trattamento con sostanze chimiche specifiche di base separatamente
- Elettroforesi del contenuto di ciascuna provetta su linee separate su gel e separazione dei frammenti in base alla loro lunghezza.
- Rilevamento dei frammenti mediante autoradiografia.
Figura 01: Sequenziamento di Maxam Gilbert
Cos'è il sequenziamento di Sanger?
Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi colleghi nel 1977 per determinare la sequenza di base di un dato frammento di DNA. È anche noto come sequenziamento della terminazione della catena o metodo di sequenziamento Dideoxy. Questo metodo funziona sul principio dell'incorporazione selettiva di dideossinucleotidi a catena (ddNTP) come ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP da parte della DNA polimerasi durante la sintesi del DNA a filamento singolo per terminare la formazione del filamento. I dideossinucleotidi mancano di gruppi 3'OH per la formazione di legami fosfodiestere con nucleotide adiacente. Quindi, la formazione del filamento si interrompe una volta che un ddNTP è incorporato nel filamento di nuova formazione durante il sequenziamento del sanger.
In questo metodo, vengono eseguite quattro reazioni di sintesi del DNA (PCR) separate in quattro provette separate con un tipo di ddNTP. Vengono forniti anche altri requisiti per le provette per PCR, inclusi primer, dNTP, Taq polimerasi, condizioni specifiche, ecc. Vengono eseguite quattro reazioni separate in quattro provette con quattro miscele. Dopo le reazioni PCR, i frammenti di DNA risultanti vengono denaturati termicamente e separati mediante elettroforesi su gel. Quindi i frammenti vengono visualizzati utilizzando un primer marcato (radioattivo o fluorescente) o dNTP come mostrato nella figura 02.
Figura 02: Sequenziamento di Sanger
Qual è la differenza tra Maxam Gilbert e Sanger Sequencing?
Sequencing Maxam Gilbert vs Sanger |
|
| Il sequenziamento di Maxam Gilbert è la prima tecnica sviluppata per il sequenziamento del DNA. | Il metodo di sequenziamento di Sanger è stato introdotto dopo il metodo di sequenziamento di Maxam Gilbert. |
| Utilizzo | |
| Questo metodo è usato raramente. | Il sequenziamento di Sanger viene utilizzato di routine per il sequenziamento. |
| Uso di sostanze chimiche pericolose | |
| Utilizza sostanze chimiche pericolose. | L'uso di sostanze chimiche pericolose è limitato rispetto al metodo Maxam Gilbert. |
| Etichettatura per il rilevamento | |
| Questo metodo utilizza P32 radioattivo per etichettare le estremità dei frammenti di DNA. | Il sequenziamento di Sanger utilizza ddNTP etichettati in modo radioattivo o fluorescente. |
Riepilogo – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Il sequenziamento di Maxam Gilbert e Sanger sono due tipi di tecniche di sequenziamento del DNA che rientrano nel sequenziamento del DNA di prima generazione. Il sequenziamento di Maxam Gilbert è il primo metodo introdotto per il sequenziamento del DNA nel 1976 e viene eseguito rompendo i frammenti di DNA etichettati all'estremità da sostanze chimiche specifiche della base. Quindi, è noto come sequenziamento chimico. Il metodo di sequenziamento Sanger è stato introdotto nel 1977 e si basa sulle reazioni di terminazione di catena guidate da ddNTP. Metodo di sequenziamento Sanger popolare rispetto al metodo Maxam Gilbert a causa di numerosi svantaggi del metodo Maxam Gilbert come il consumo eccessivo di tempo, l'uso di sostanze chimiche pericolose, ecc. Questa è la differenza tra il sequenziamento di Maxam Gilbert e Sanger.
