Differenza chiave: clonazione genica vs PCR
La sintesi di molte copie di DNA da uno specifico frammento di DNA è chiamata amplificazione del DNA. Esistono due principali processi di amplificazione del DNA: clonazione genica e PCR. Il differenza fondamentale tra clonazione genica e PCR è che la clonazione genica produce le copie multiple di un gene specifico in vivo costruendo un DNA ricombinante e crescendo all'interno di un batterio ospite mentre la PCR produce milioni di copie di uno specifico frammento di DNA in vitro subendo cicli ripetuti di denaturazione e sintesi.
Cos'è la clonazione genetica?
La clonazione genica è una tecnica impiegata per localizzare e moltiplicare un gene specifico dal DNA genomico estratto di un organismo attraverso la costruzione di DNA ricombinante. Il DNA genomico contiene migliaia di geni diversi codificati per proteine. Quando il DNA viene estratto, include tutti i possibili geni che può sopportare. La tecnica di clonazione genica ha consentito di rilevare un gene specifico dal DNA totale. Pertanto la clonazione genetica funge da strumento importante nella biologia molecolare.
La creazione di una libreria genomica di un organismo è essenziale nella clonazione del gene se non si ha la minima idea della posizione del gene rilevante nel DNA. Viene creata una libreria genomica utilizzando i seguenti passaggi.
Fase 1: Estrazione del DNA totale da un organismo che contiene il gene desiderato.
Fase 2: Digestione di restrizione del DNA estratto per produrre piccoli frammenti gestibili. Questo passaggio è facilitato dalle endonucleasi di restrizione.
Fase 3: Selezione di un vettore adatto e apertura del vettore DNA utilizzando le stesse endonucleasi di restrizione. I plasmidi batterici sono comunemente usati come vettori per trasportare DNA estraneo. I plasmidi sono piccoli cerchi di DNA situati all'interno dei batteri.
Fase 4: Combinazione del DNA vettore e del DNA frammentato per produrre una molecola di DNA ricombinante. Questo passaggio è governato dalla DNA ligasi.
Fase 5: Trasferimento di molecole di DNA ricombinante nei batteri ospiti. Questo passaggio è noto come trasformazione e viene eseguito utilizzando uno shock termico.
Fase 5: Screening delle cellule batteriche trasformate su un mezzo di coltura. Alla fine del processo di trasformazione si ottiene una popolazione mista di cellule ospiti trasformate e non trasformate. Poiché il gene di interesse include solo nelle cellule ospiti trasformate. Quindi, è necessario selezionare le celle trasformate. La selezione viene effettuata utilizzando terreni selettivi che contengono antibiotici. Solo le cellule trasformate crescono su questo mezzo di screening consentendo la selezione.
Fase 6: crescita di batteri per produrre una libreria genetica. In questa fase, le cellule ospiti trasformate vengono introdotte in terreni di coltura freschi che forniscono requisiti di crescita ottimali. Le colonie totali sulle piastre di coltura rappresentano la libreria genomica di quell'organismo.
Fase 7: La molecola di DNA ricombinante contenente il gene di interesse deve essere sottoposta a screening da migliaia di frammenti clonati di DNA ricombinante. Può essere ottenuto mediante l'uso di sonde che contrassegnano il gene specifico o la proteina specifica risulta da quel gene.
Una volta identificato il gene interessato contenente la colonia batterica dalle colonie totali, è possibile fare milioni di copie del plasmide ricombinante che contiene il gene.
La clonazione genica viene utilizzata per creare librerie di geni, produrre proteine speciali, vitamine, antibiotici, ormoni, sequenziare e mappare i genomi degli organismi, creare copie multiple del DNA di individui in medicina legale, ecc.
Figura_1: clonazione genica
Cos'è la PCR?
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica che genera un gran numero di copie di un particolare frammento di DNA. L'amplificazione esponenziale di una specifica sequenza di DNA è ottenuta mediante PCR in condizioni in vitro. Questa tecnica è uno strumento molto potente in biologia molecolare poiché può moltiplicare un piccolo campione di DNA in una quantità utilizzabile. La PCR è stata introdotta da Kary Mullis nel 1983 e questa premiata invenzione ha creato un enorme progresso nella biologia molecolare.
La tecnica
PCR segue reazioni PCR ripetute come mostrato nella Figura 02. Una reazione PCR consiste in tre fasi principali che si verificano a tre diverse temperature; denaturazione del doppio filamento al DNA a 94 0C, annealing dei primer a 68 0C e allungamento del filamento a 72 0 C. Pertanto, quando viene eseguita la PCR, la fluttuazione della temperatura deve essere altamente mantenuta per una corretta replicazione. La PCR viene eseguita in una macchina per PCR all'interno di provette per PCR. Le provette per PCR vengono caricate con miscele PCR corrette contenenti DNA stampo, Taq polimerasi, primer, dNTP e tampone. La denaturazione del DNA campione a doppio filamento in DNA a filamento singolo viene effettuata rompendo i legami idrogeno tra basi complementari a 94 – 98 0C. Quindi i singoli filamenti di DNA stampo vengono esposti per i primer. Dovrebbe essere fornito un paio di primer (avanti e indietro) e dovrebbero essere termostabili per tollerare le alte temperature. I primer sono brevi sequenze di DNA a filamento singolo complementari alle estremità del frammento di DNA bersaglio. I primer sintetici sono usati nella PCR. I primer si legano alle basi complementari del DNA del campione e avviano la sintesi di un nuovo filamento. Questo passaggio è catalizzato da un enzima chiamato Taq polimerasi; un enzima DNA polimerasi termostabile isolato da Thermus auqaticus. Quando sono disponibili primer e nucleotidi (mattoni), Taq polimerasi costruisce il nuovo filamento di DNA complementare al DNA stampo. Alla fine del programma PCR, il frammento di DNA amplificato viene osservato mediante elettroforesi su gel. Se sono necessarie ulteriori analisi, il prodotto della PCR viene purificato dal gel.
PCR è molto utile per la diagnosi e il monitoraggio di malattie genetiche e acquisite, l'identificazione di criminali (nel campo della medicina legale), lo studio della struttura e della funzione di un segmento mirato di DNA, il sequenziamento e la mappatura dei genomi degli organismi, ecc. La PCR è diventata una tecnica di laboratorio di routine nei laboratori di ricerca medica e di biologia molecolare tra gli scienziati poiché ha un'ampia varietà di applicazioni.
Figura_2: Reazione a catena della polimerasi
Qual è la differenza tra clonazione genica e PCR?
Clonazione genica vs PCR |
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| La clonazione genica è il processo di creazione di copie multiple di un gene specifico in vivo attraverso il DNA ricombinante e la trasformazione in un batterio ospite. | La tecnica PCR produce copie multiple di una particolare sequenza di DNA in vitro attraverso cicli ripetuti di reazioni PCR. |
| Requisito per la costruzione del DNA ricombinante | |
| Il DNA ricombinante viene prodotto per localizzare il gene. | Il DNA ricombinante non viene prodotto. |
| Necessità di manodopera | |
| Questo processo richiede molto lavoro. | Non è necessario un lavoro intensivo. |
| Processo in vivo o in vitro | |
| La costruzione del DNA ricombinante è in vitro e l'amplificazione del DNA è in vivo. | L'amplificazione del DNA avviene completamente in vitro. |
Riepilogo – Clonazione genica vs PCR
La clonazione genica e la PCR sono due metodi utilizzati per l'amplificazione del DNA. La PCR è un processo in vitro che esegue copie multiple del DNA di un particolare frammento di DNA senza utilizzare il DNA ricombinante e un organismo ospite. La clonazione genica è principalmente un processo in vivo che si traduce in copie multiple di un gene interessato all'interno dell'organismo ospite attraverso la costruzione di DNA ricombinante. Questa è la differenza tra clonazione genica e PCR.
