La differenza fondamentale tra la traduzione del nick e il riempimento finale è che la traduzione del nick è un processo che crea sonde di DNA etichettate per varie reazioni di ibridazione mentre il riempimento finale è una tecnica che crea frammenti smussati aggiungendo nucleotidi in sporgenze a filamento singolo.
La traduzione di Nick e il riempimento finale sono due tecniche utilizzate in biologia molecolare. La traduzione del nick viene utilizzata per etichettare le sonde per l'ibridazione al fine di rilevare specifiche sequenze nucleotidiche. Il riempimento finale viene utilizzato per creare frammenti smussati che avevano estremità appiccicose con sporgenze a filamento singolo. Entrambe le tecniche hanno una grande importanza e vengono eseguite di routine nei laboratori di ricerca molecolare.
Cos'è Nick Translation?
La traduzione di Nick è un'importante tecnica utilizzata per preparare sonde etichettate per varie tecniche di biologia molecolare come blotting, ibridazione in situ, ibridazione in situ fluorescente, ecc. È un metodo in vitro di etichettatura del DNA. Le sonde del DNA vengono utilizzate per identificare specifiche sequenze di DNA o RNA. Con l'aiuto di una sonda etichettata, frammenti specifici possono essere contrassegnati o visualizzati da una complessa miscela di acido nucleico. Pertanto le sonde etichettate vengono preparate utilizzando varie tecniche. La traduzione del nick è uno di questi metodi che produce sonde etichettate con l'aiuto degli enzimi DNasi 1 e DNA polimerasi 1.
Figura 01: Nick Translation
Il processo di traduzione di Nick inizia con l'attività dell'enzima DNasi 1. La DNasi 1 introduce scalfitture nella spina dorsale fosfatica del DNA a doppio filamento scindendo i legami fosfodiestere tra i nucleotidi. Una volta creato il nick, verrà prodotto il gruppo 3 'OH libero del nucleotide e l'enzima DNA polimerasi 1 agirà su di esso. L'attività esonucleasica da 5′ a 3′ della DNA polimerasi 1 rimuove i nucleotidi dalla tacca verso la direzione 3′ del filamento di DNA.
Contemporaneamente, l'attività della polimerasi dell'enzima DNA polimerasi 1 funziona e aggiunge nucleotidi per sostituire i nucleotidi rimossi. Se i nucleotidi sono etichettati, la sostituzione avverrà con i nucleotidi etichettati e segnerà il DNA per l'identificazione. Infine, questo DNA marcato di nuova sintesi può essere utilizzato come sonda in varie reazioni di ibridazione.
Cos'è il riempimento finale?
Il riempimento terminale è una tecnica utilizzata in biologia molecolare per creare frammenti smussati. La digestione di restrizione produce frammenti con sporgenze. Questi frammenti potrebbero non essere compatibili per legarsi in vettori plasmidici. I vettori sono spesso smussati per consentire l'unione di estremità non compatibili. Pertanto, i frammenti con sporgenze possono essere smussati aggiungendo i nucleotidi al filamento complementare utilizzando la sporgenza come modello per la polimerizzazione. Questo processo è noto come riempimento finale.
DNA polimerasi come il frammento Klenow della DNA polimerasi I e T4 DNA polimerasi catalizzano il riempimento finale. Aggiungono nucleotidi per riempire (5′ → 3′) e masticare (3′ → 5′). Una volta riempite le estremità appiccicose, diventano smussate e sono pronte per essere legate in un vettore.
Inoltre, il riempimento delle estremità può essere utilizzato per etichettare le molecole di DNA. Tuttavia, può essere utilizzato solo per etichettare le molecole di DNA con estremità appiccicose. Rispetto alla traduzione del nick, il riempimento delle estremità è un metodo più delicato che raramente provoca rotture del DNA.
Quali sono le somiglianze tra Nick Translation e End Filling?
- Sia la traduzione del nick che il riempimento finale sono tecniche di biologia molecolare.
- Possono essere usati per etichettare le sonde.
- Entrambi sono in vitro
Qual è la differenza tra Nick Translation e End Filling?
La traduzione di Nick è una tecnica che crea sonde etichettate per l'ibridazione. Al contrario, il riempimento delle estremità è una tecnica che crea frammenti smussati per la legatura nei vettori. Quindi, questa è la differenza chiave tra la traduzione del nick e il riempimento finale. Inoltre, la traduzione di Nick richiede l'uso dell'attività esonucleasica da 5' a 3' mentre il riempimento finale non richiede l'attività esonucleasica da 5' a 3'.
L'infografica di seguito elenca le differenze tra la traduzione del nick e il riempimento finale in modo più dettagliato.
Riepilogo – Nick Translation vs End Filling
La traduzione di Nick è un metodo che incorpora nucleotidi radiomarcati nel DNA. Sintetizza sonde marcate in base alle attività degli enzimi DNasi 1 ed E. coli DNA polimerasi 1. Il riempimento finale, invece, è una tecnica che produce frammenti smussati. Quando i frammenti hanno estremità appiccicose (sporgenze a filamento singolo), è necessario renderle estremità smussate per legarsi in vettori. Il riempimento terminale aggiunge nucleotidi compatibili e crea frammenti terminali smussati per renderli compatibili per la legatura. Pertanto, questo riassume la differenza tra la traduzione del nick e il riempimento finale.
