Differenza chiave: traduzione Nick e estensione Primer
La traduzione di Nick e l'estensione del primer sono due importanti tecniche eseguite in biologia molecolare. Il differenza fondamentale tra la traduzione del nick e l'estensione del primer è quello il processo di traduzione del nick produce sonde etichettate per altre tecniche di ibridazione mentre il metodo di estensione del primer identifica una sequenza di RNA specifica da una miscela e rivela informazioni sull'espressione dell'mRNA. Entrambe le tecniche hanno grande importanza e vengono eseguite di routine nei laboratori di ricerca molecolare.
Cos'è Nick Translation?
La traduzione di Nick è un'importante tecnica utilizzata per preparare sonde etichettate per varie tecniche di biologia molecolare come blotting, ibridazione in situ, ibridazione fluorescente in situ ecc. È un metodo in vitro di etichettatura del DNA. Le sonde del DNA vengono utilizzate per identificare specifiche sequenze di DNA o RNA. Con l'aiuto di una sonda etichettata, frammenti specifici possono essere contrassegnati o visualizzati da una complessa miscela di acido nucleico. Pertanto, le sonde etichettate vengono preparate utilizzando varie tecniche da utilizzare per tecniche diverse. La traduzione del nick è uno di questi metodi che produce sonde etichettate con l'aiuto degli enzimi DNasi 1 e DNA polimerasi 1.
Il processo di traduzione del nick inizia con l'attività dell'enzima DNasi 1. La DNasi 1 introduce scalfitture nella spina dorsale fosfatica del DNA a doppio filamento scindendo i legami fosfodiestere tra i nucleotidi. Una volta creato il nick, verrà prodotto il gruppo 3'OH libero del nucleotide e l'enzima DNA polimerasi 1 agirà su di esso. L'attività esonucleasica da 5' a 3' della DNA polimerasi 1 rimuove i nucleotidi dalla tacca verso la direzione 3' del filamento di DNA. Contemporaneamente, l'attività della polimerasi dell'enzima DNA polimerasi 1 funziona e aggiunge nucleotidi per sostituire i nucleotidi rimossi. Se i nucleotidi sono stati etichettati, la sostituzione avverrà con i nucleotidi etichettati e segnerà il DNA per l'identificazione. Questo DNA marcato di nuova sintesi può essere utilizzato come sonde in varie reazioni di ibridazione in biologia molecolare.
Figura 01: Processo di traduzione di Nick
Cos'è l'estensione Primer?
L'estensione Primer è una tecnica che viene utilizzata per trovare una sequenza di RNA specifica da una miscela di RNA e individuare l'estremità 5' del trascritto dell'mRNA. Viene anche utilizzato per studiare la struttura dell'RNA e l'espressione. Il metodo di estensione del primer viene eseguito con primer marcati o con nucleotidi marcati. Se si utilizzano primer marcati, si esclude la necessità di etichettare i nucleotidi utilizzati per la sintesi del cDNA. Ci sono diversi passaggi in questa tecnica. Si inizia con l'estrazione dell'RNA dal campione. Quindi un primer oligonucleotidico marcato viene aggiunto alla miscela insieme agli ingredienti necessari per sintetizzare il cDNA di una specifica sequenza di RNA. Il primer ricottura con la sequenza complementare della miscela. Usando la sequenza di primer ricotto come modello, l'enzima trascrittasi inversa sintetizza il DNA complementare (cDNA) della sequenza di RNA. La ricottura del primer e la trascrizione inversa si verificano solo quando la sequenza di RNA specifica è presente nel campione. Infine, quando viene eseguita l'elettroforesi su gel di denaturazione, è possibile determinare la dimensione della sequenza di RNA. È anche facile trovare la base +1 della sequenza di mRNA (sito di inizio della trascrizione) mediante il metodo di estensione del primer. La quantità di mRNA presente nel campione può essere quantificata con questo metodo se viene utilizzato un primer in eccesso.
Figura 02: Estensione del primer
Qual è la differenza tra Nick Translation e Primer Extension?
Traduzione Nick vs Estensione Primer |
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| La traduzione di Nick è un processo che crea sonde di DNA etichettate per varie reazioni di ibridazione. | L'estensione Primer è una tecnica utilizzata per trovare RNA specifico o per studiare l'espressione genica. |
| Enzimi utilizzati | |
| Si utilizzano enzimi DNasi 1 e DNA polimerasi. | Viene utilizzato l'enzima trascrittasi inversa. |
| Importanza | |
| La traduzione di Nick facilita la marcatura di una specifica sequenza di DNA. | L'estensione Primer consente il rilevamento della dimensione specifica della sequenza di mRNA e della quantità presente nel campione. |
Riepilogo – Nick Translation vs Primer Extension
La traduzione di Nick è un metodo utilizzato per sintetizzare sonde marcate in base alle attività degli enzimi DNasi 1 ed E coli DNA polimerasi 1. È un metodo in vitro impiegato nei laboratori prima di diverse tecniche di ibridazione. Durante la traduzione del nick, l'attività esonucleasica 5'-3' della DNA polimerasi 1 rimuove i nucleotidi prima del nick e l'attività della polimerasi della DNA polimerasi 1 sostituisce i nucleotidi rimossi con nucleotidi etichettati dietro il nick. L'estensione del primer è un metodo utilizzato per rilevare una specifica trascrizione di RNA da una miscela e quantificare la dimensione e la quantità dell'RNA di interesse. Questa è la differenza tra la traduzione del nick e l'estensione del primer.
