Differenza chiave: primer per PCR vs primer per sequenziamento
Con i recenti sviluppi nel campo della biologia molecolare, sono state sviluppate diverse tecniche genetiche che hanno reso facili e accurati i processi di indagine delle diverse vie della materia. La PCR e altre procedure di sequenziamento sono due importanti tecniche di questo tipo. Usano diversi sottocomponenti. I primer sono considerati il principale sottocomponente comune sia alle tecniche di PCR che di sequenziamento. I primer PCR vengono utilizzati per l'amplificazione di una particolare sequenza di DNA, mentre i primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelare il suo ordine specifico della sequenza nucleotidica. Questa è la differenza fondamentale tra primer PCR e primer di sequenziamento.
Cosa sono i primer per PCR?
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica genetica utilizzata nel campo della biologia molecolare per amplificare una o poche copie di un particolare segmento di DNA e ottenere molti milioni di copie identiche. In una reazione PCR, vengono utilizzati diversi componenti inclusi i primer. I primer sono brevi filamenti di DNA con una lunghezza del nucleotide di 18-25 che li rende compatibili con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA da amplificare. I primer possono essere un primer diretto e un primer inverso. Questi primer si legano al frammento di DNA nei punti specifici in cui fa sì che la DNA polimerasi si leghi al primer specifico nella posizione e avviano la sintesi del nuovo filamento di DNA.
La selezione dei primer è un aspetto importante del processo PCR. La scelta della lunghezza del primer è importante. La lunghezza ideale sarebbe 18-25 nucleotidi. Se la lunghezza è troppo corta o troppo lunga, i primer non si legheranno alla sequenza di DNA per essere amplificati accuratamente. I primer di lunghezza troppo breve portano a una ricottura del primer non specifica in diverse posizioni della sequenza di DNA.
Figura 01: Primer per PCR
Il contenuto di guanina e citosina (GC) in un buon primer dovrebbe essere compreso tra 40 e 60. La temperatura di ricottura del primer e la temperatura di fusione sono fattori vitali durante la PCR. La temperatura di fusione deve essere calcolata accuratamente e la temperatura di ricottura del primer dovrebbe essere 5 0C inferiore alla temperatura di fusione. La temperatura di fusione dovrebbe essere 60 °C e 75 °C. Temperature troppo alte o troppo basse risulteranno in un'attività della DNA polimerasi meno attiva.
Cosa sono i primer per il sequenziamento?
I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. Per ottenere buoni risultati di sequenziamento sono importanti primer e modelli di alta qualità. Pertanto, quando vengono selezionati i primer, dovrebbero essere unici per una particolare regione in cui desideriamo eseguire la sequenza. Dovrebbe anche essere con un orientamento corretto in cui le sequenze vengono solitamente generate da 3 'a 5' estremità dei primer. La sequenza dovrebbe essere priva di autoibridazione indesiderabile come la formazione di anelli a forcina. Non dovrebbe contenere la formazione consecutiva di basi di guanina.
La temperatura di fusione (Tm) del primer deve essere adeguata alle condizioni del sequenziamento. Pertanto, dovrebbe essere compreso tra 52oC e 74oC. La preparazione di oligonucleotidi da utilizzare come primer deve essere purificata per ottenere l'intera lunghezza desiderata della sequenza. Se gli oligonucleotidi contengono impurità, la segnalazione della sequenza di primer verrà sovrapposta da diversi siti di priming e diminuirà anche il numero di cellule base.
Figura 02: Sequenziamento dei primer
La temperatura di fusione del primer (Tm) di un oligonucleotide determina la forza dell'ibridazione tra i filamenti di DNA complementari. Tm può essere considerato un calcolo termodinamico in cui dipende sia dalle sequenze di DNA che da diverse condizioni come la concentrazione di sale. Il Tm è importante durante la PCR in cui una variante chiamata sequenziamento del ciclo viene utilizzata per produrre un gruppo di frammenti terminati con dideossinucleotide. Qui, il primer che viene sequenziato verrà inizialmente ricotto in alternativa, quindi esteso e infine denaturato per l'amplificazione. Pertanto, il valore di Tm dovrebbe essere compreso tra 52oC e 74oC. Gli oligonucleotidi sintetizzati possono essere ottenuti dai laboratori di sintesi di DNA/RNA secondo scelta. La piccola scala di sintesi utilizzata per il sequenziamento del DNA è solitamente di 50 nmol. Inoltre, cosa più importante, i primer utilizzati per il sequenziamento dovrebbero essere purificati per essere privi di impurità che impediranno la riduzione della qualità.
Quali sono le somiglianze tra primer per PCR e primer per sequenziamento?
- Sia i primer per PCR che i primer per il sequenziamento sono primer utilizzati nel processo di amplificazione di una sequenza di DNA mirata.
- Sia i primer PCR che i primer di sequenziamento sono composti da nucleotidi.
- Sia i primer per PCR che i primer per il sequenziamento sono oligomeri corti.
Qual è la differenza tra primer per PCR e primer per sequenziamento?
PCR Primer vs Sequencing Primer |
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| I primer PCR sono brevi filamenti di DNA con una lunghezza della sequenza nucleotidica di 18-25 che li rende compatibili con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA che devono essere amplificati. | I primer di sequenziamento sono brevi oligomeri utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. |
| Funzione | |
| I primer PCR vengono utilizzati per l'amplificazione di una particolare sequenza di DNA. | I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. |
| Numero di primer necessari | |
| Due primer; un primer forward e un primer reverse vengono utilizzati come primer PCR. | Ha bisogno di un solo primer come primer di sequenziamento. |
Riepilogo – Primer per PCR vs primer per sequenziamento
I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. Un primer di sequenziamento sarà sufficiente per eseguire il processo. Per ottenere buoni risultati di sequenziamento, sono importanti primer e modelli di alta qualità. Pertanto, quando vengono selezionati i primer, dovrebbero essere unici per una particolare regione in cui desideriamo eseguire la sequenza. I primer per PCR sono filamenti di DNA corti con una lunghezza del nucleotide di 18-25 che è compatibile con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA che devono essere amplificati. I primer per PCR possono essere un primer diretto e un primer inverso. Il contenuto di guanina e citosina (GC) in un buon primer dovrebbe essere compreso tra 40 e 60. La temperatura di ricottura del primer e la temperatura di fusione sono aspetti vitali durante la PCR. Questa è la differenza tra primer PCR e primer di sequenziamento.
