Differenza chiave – PCR vs sequenziamento del DNA
PCR e sequenziamento del DNA sono due tecniche importanti in biologia molecolare. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è il processo che crea un gran numero di copie di un frammento di DNA. Il sequenziamento del DNA è la tecnica che determina l'ordine preciso dei nucleotidi di un dato frammento di DNA. Questa è la differenza chiave tra PCR e sequenziamento del DNA. La PCR è uno dei passaggi principali coinvolti nel sequenziamento del DNA.
Cos'è la PCR?
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di amplificazione del DNA utilizzata in biologia molecolare. Produce da migliaia a milioni di copie di un particolare frammento di DNA. Questo metodo è stato sviluppato da Kary Mullis nel 1983. In questa tecnica, il frammento di DNA da amplificare funge da stampo e l'enzima DNA polimerasi aggiunge nucleotidi complementari al primer che è disponibile nella miscela PCR. Al termine della reazione PCR, vengono sintetizzate molte copie del DNA del campione.
Ci sono diversi componenti della miscela PCR, tra cui DNA, DNA polimerasi (Taq polimerasi), primer (primer in avanti e inverso), nucleotidi (mattoni del DNA) e un tampone. La PCR avviene all'interno di una macchina PCR e la miscela PCR corretta deve essere caricata nella macchina e deve essere guidato il programma corretto. Questa tecnica consente la produzione da migliaia a milioni di copie di una particolare sezione di DNA da una quantità molto piccola di DNA.
Le reazioni PCR si verificano in modo ciclico per produrre la quantità visibile di prodotti PCR su un gel. Ci sono tre fasi principali coinvolte in una reazione PCR, vale a dire la denaturazione, la ricottura del primer e l'estensione del filamento, come mostrato nella Figura 01. Questi tre passaggi si verificano a tre diverse temperature. Il DNA esiste in forma a doppio filamento da legami idrogeno tra le basi complementari. Prima dell'implicazione, il DNA a doppio filamento dovrebbe essere separato l'uno dall' altro. Si fa dando una temperatura elevata. Ad alta temperatura, il DNA a doppio filamento si denatura in filamenti singoli. Quindi i primer dovrebbero avvicinarsi alle estremità fiancheggianti del frammento specifico o del gene del DNA. Il primer è un breve pezzo di DNA a filamento singolo complementare alla sequenza bersaglio. I primer diretti e inversi si ricoprono con le basi complementari alle estremità fiancheggianti del DNA del campione denaturato alla temperatura di ricottura. I primer dovrebbero essere resistenti al calore. Una volta che i primer si ricoprono con il DNA campione, l'enzima taq polimerasi avvia la sintesi dei nuovi filamenti aggiungendo nucleotidi complementari al DNA bersaglio. La Taq polimerasi è un enzima termostabile isolato da un batterio termofilo chiamato Thermus aquaticus. Il tampone PCR mantiene le condizioni ottimali per l'azione della taq polimerasi. Queste tre fasi delle reazioni PCR vengono ripetute per produrre la quantità richiesta di prodotto PCR. Dopo ogni reazione PCR, il numero della copia del DNA viene raddoppiato. Quindi, un'amplificazione esponenziale può essere osservata nella PCR. I prodotti della PCR possono essere osservati mediante elettroforesi su gel e possono essere purificati per ulteriori studi.
Figura 01: Fasi principali di una reazione PCR
La PCR è uno strumento prezioso nella ricerca medica e biologica. La PCR ha un valore speciale nella scienza forense poiché può amplificare il DNA per studi dai minuscoli campioni dei criminali e creare profili di DNA forense. La PCR è ampiamente utilizzata in molte aree della biologia molecolare, tra cui genotipizzazione, clonazione genica, rilevamento di mutazioni, sequenziamento del DNA, microarray di DNA e test di paternità, ecc.
Figura 02: Reazione a catena della polimerasi
Cos'è il sequenziamento del DNA?
Il sequenziamento del DNA è la determinazione di un ordine preciso dei nucleotidi – adenina, guanina, citosina e timina in un dato frammento di DNA. Le informazioni genetiche vengono memorizzate nelle sequenze di DNA utilizzando l'ordine corretto dei nucleotidi. Quindi, trovare l'ordine preciso dei nucleotidi in un frammento di DNA è molto importante per conoscere la struttura e la funzione dei geni.
Il protocollo di sequenziamento del DNA coinvolge diversi processi. Il primo passo è l'isolamento del DNA interessato o del DNA genomico di un organismo. Usando la PCR (come descritto sopra), la regione desiderata del DNA deve essere amplificata. Il prodotto PCR amplificato deve essere separato mediante elettroforesi su gel e purificato. I frammenti amplificati sono serviti come modelli per il sequenziamento. Il sequenziamento può essere eseguito seguendo il sequenziamento Sanger o il metodo di sequenziamento ad alto rendimento. Il sequenziamento di Sanger richiede l'elettroforesi capillare dei frammenti di DNA risultanti. La determinazione del corretto ordine nucleotidico può essere effettuata mediante lettura manuale di autoradiografie o utilizzando sequenziatori di DNA automatizzati.
Il sequenziamento genico ha contribuito al progetto Genoma umano e ha facilitato la mappatura del genoma umano nel 2003. In medicina legale, il sequenziamento del DNA ha consentito l'identificazione di individui che mostrano sequenze di DNA uniche e identificano i criminali. In medicina, il sequenziamento del DNA può essere utilizzato per rilevare i geni responsabili di malattie genetiche e di altro tipo, trovare geni difettosi e sostituirli con geni corretti. In agricoltura, le informazioni sul sequenziamento del DNA di alcuni microrganismi vengono utilizzate per produrre colture transgeniche con caratteristiche economicamente desiderate.
Figura 03: Sequenziamento del DNA
Qual è la differenza tra PCR e sequenziamento del DNA?
PCR vs sequenziamento del DNA |
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| Il processo PCR crea da migliaia a milioni di copie del frammento di DNA interessato. | Il sequenziamento del DNA è il processo per determinare l'ordine preciso dei nucleotidi in un dato frammento di DNA. |
| Risultato | |
| La PCR crea da migliaia a milioni di copie di un particolare frammento di DNA | Ciò si traduce nell'ordine corretto delle basi in un particolare frammento di DNA. |
| Coinvolgimento di ddNTP | |
| PCR non richiede ddNTP. Utilizza dNTP. | Il sequenziamento del DNA richiede ddNTP per terminare la formazione del filamento. |
Riepilogo – PCR vs sequenziamento del DNA
PCR e sequenziamento del DNA sono strumenti molto importanti in molte aree della biologia molecolare. L'amplificazione dei frammenti di DNA viene eseguita mediante la tecnica della PCR mentre l'ordine corretto dei nucleotidi di un frammento di DNA è determinato dal sequenziamento del DNA. Questa è la differenza tra PCR e sequenziamento del DNA.
