La differenza fondamentale tra la messa a fuoco della cromatografia e la messa a fuoco isoelettrica è quella la messa a fuoco della cromatografia è un tipo di metodo di cromatografia su colonna che utilizza resine a scambio ionico mentre la messa a fuoco isoelettrica è un tipo di tecnica di elettroforesi che utilizza gel con gradiente di pH immobilizzato.
Il cromatofocus e il focus isoelettrico sono due tecniche che separano le proteine in base ai loro punti isoelettrici. Sia la messa a fuoco cromatica che quella isoelettrica hanno un grande potere risolutivo. La cromatografia è un metodo di cromatografia su colonna ad alta risoluzione mentre la focalizzazione isoelettrica è un metodo di separazione elettroforetica. Inoltre, la messa a fuoco cromatica non utilizza un campo elettrico mentre la messa a fuoco isoelettrica necessita di un campo elettrico.
Cos'è la messa a fuoco cromatica?
Il cromatofocus è un tipo di cromatografia ad alta eluizione che separa le proteine in base alle differenze nel loro punto isoelettrico. Utilizza una colonna di resina a scambio ionico e un gradiente di pH sviluppato internamente. A differenza della focalizzazione isoelettrica, la cromatografia non comporta un campo elettrico. Il cromatofocus è una potente tecnica di purificazione in grado di risolvere molecole molto simili anche solo con una differenza di 0,02 unità di pH. Pertanto, la messa a fuoco cromatica è più adatta come fase di lucidatura finale quando è richiesta un' alta risoluzione per separare componenti molto simili.
Nella cromatografia, il campione viene applicato alla colonna miscelandolo con il buffer iniziale. Le proteine che si trovano a un pH al di sopra del loro punto isoelettrico sono caricate negativamente e rimangono vicino alla parte superiore della colonna mentre altre proteine che si trovano a un pH al di sotto del loro punto isoelettrico, migrano lungo la colonna. La proteina con il punto isoelettrico più alto viene eluita per prima mentre la proteina con il punto isoelettrico più basso viene eluita per ultima dalla colonna. Questa tecnica è influenzata da diversi fattori come la precipitazione delle proteine e la linearità del gradiente di pH.
Cos'è la messa a fuoco isoelettrica?
La focalizzazione isoelettrica è una tecnica che separa diverse molecole in base al loro punto isoelettrico. È anche noto come elettrofocalizzazione. Questa tecnica viene spesso utilizzata per la separazione delle proteine in un gel. Nella focalizzazione isoelettrica, il campione viene aggiunto in gel con gradiente di pH immobilizzato (IPG). Il gel IPG è una matrice di gel di acrilammide copolimerizzata con un gradiente di pH. Le proteine migrano verso il catodo fino a trovare la regione del pH dei loro punti isoelettrici. Quando una proteina raggiunge il pH che non ha carica netta, la migrazione cessa e dà una banda stazionaria. Allo stesso modo, ogni proteina fornisce una banda in un punto del gradiente di pH corrispondente al suo punto isoelettrico.
Figura 01: Messa a fuoco isoelettrica
La focalizzazione isoelettrica è il primo passo dell'elettroforesi su gel bidimensionale. In tale tecnica, le proteine vengono prima separate in base ai loro punti isoelettrici mediante focalizzazione isoelettrica e quindi separate in base al loro peso molecolare tramite SDS-PAGE.
Quali sono le somiglianze tra la messa a fuoco cromatica e la messa a fuoco isoelettrica?
- La messa a fuoco cromatica e la messa a fuoco isoelettrica sono due metodi altamente risolutivi.
- Entrambi sono basati sul punto isoelettrico delle proteine.
- Queste tecniche utilizzano un gradiente di pH.
- Entrambe le procedure sono informative per la caratterizzazione delle varianti dell'emoglobina umana.
- Possono risolvere molecole in cui i valori di pI differiscono di appena 0,02 unità di pH.
Qual è la differenza tra la messa a fuoco cromatica e la messa a fuoco isoelettrica?
Il cromatofocus è una tecnica di cromatografia su colonna ad alta risoluzione che separa le proteine in base al loro punto isoelettrico. Al contrario, la focalizzazione isoelettrica è una tecnica elettroforetica che separa le proteine in base al loro punto isoelettrico mediante l'applicazione di un campo elettrico lungo un gradiente di pH formato in un capillare. Quindi, questa è la differenza chiave tra la messa a fuoco cromatografica e la messa a fuoco isoelettrica.
Un' altra differenza tra la messa a fuoco cromatica e la messa a fuoco isoelettrica è che la messa a fuoco cromatica non implica un campo elettrico mentre la messa a fuoco isoelettrica richiede un campo elettrico.
Riepilogo – Messa a fuoco cromatica vs messa a fuoco isoelettrica
La focalizzazione cromatica e la focalizzazione isoelettrica sono due tecniche simili che hanno un'elevata capacità di risoluzione delle molecole, in particolare molecole molto simili. La cromatografia è una tecnica di cromatografia su colonna ad alta risoluzione mentre la focalizzazione isoelettrica è un metodo di elettroforesi. La messa a fuoco cromatica non comporta un campo elettrico, a differenza della messa a fuoco isoelettrica. Pertanto, questo riassume la differenza tra messa a fuoco cromato e messa a fuoco isoelettrica.
