La differenza chiave tra i saggi PCR nidificati convenzionali e quelli PCR in tempo reale è che la PCR convenzionale è una tecnica sviluppata per amplificare sequenze specifiche di DNA e la PCR nidificata è una modifica della PCR convenzionale che consiste in due reazioni di amplificazione sequenziali, mentre -time PCR è una variante della PCR convenzionale in grado di quantificare il prodotto amplificato.
PCR è una tecnica scientifica molto comune ampiamente utilizzata nella ricerca e nella medicina per rilevare il DNA. I test PCR vengono utilizzati per rilevare gli antigeni rilevando il loro DNA o RNA. In genere, l'RNA virale è presente nel corpo prima di rilevare gli anticorpi o visualizzare i sintomi della malattia. Un test PCR può dire se qualcuno ha o meno il virus all'inizio. Attualmente, la PCR è il test standard per rilevare la malattia COVID-19. Esistono diversi tipi di tecniche PCR come PCR in tempo reale, PCR annidata, PCR multiplex, PCR hot start e PCR a lungo raggio, ecc.
Cosa sono i saggi PCR convenzionali?
Il test PCR convenzionale è una tecnica di amplificazione del DNA in vitro eseguita di routine nei laboratori di biologia molecolare. Questo metodo ha consentito la produzione da migliaia a milioni di copie di un particolare frammento di DNA. Kary Mullis ha introdotto questa tecnica nel 1980. Questa tecnica richiede un frammento di DNA noto come modello per poterne fare molte copie. La Taq polimerasi agisce come l'enzima DNA polimerasi e catalizza la sintesi di nuovi filamenti della sequenza stampo.
I primer nella miscela PCR funzioneranno come punti di partenza per le estensioni dei frammenti. Tutti gli ingredienti necessari per fare copie del DNA sono inclusi nella miscela PCR. La reazione PCR viene eseguita in una macchina PCR e deve essere alimentata con la miscela PCR corretta e il programma PCR corretto. Se la miscela di reazione e il programma sono corretti, produrrà il numero richiesto di copie di una particolare sezione di DNA da una quantità molto piccola di DNA.
Figura 01: saggio PCR convenzionale
Ci sono tre fasi principali coinvolte in una reazione PCR: denaturazione, annealing del primer ed estensione del filamento. Questi tre passaggi si verificano a tre diverse temperature. Il tampone PCR mantiene le condizioni ottimali per l'azione della Taq polimerasi. Queste tre fasi della reazione PCR vengono ripetute per produrre la quantità richiesta del prodotto PCR. Ad ogni reazione PCR, il numero di copie del DNA raddoppia. Quindi, l'amplificazione esponenziale può essere osservata nella PCR. Il prodotto della PCR può essere risolto utilizzando l'elettroforesi su gel poiché produce una quantità visibile di DNA su un gel e può essere purificato per ulteriori studi come il sequenziamento.
PCR è uno strumento prezioso nella ricerca medica e biologica. Soprattutto negli studi forensi, la PCR ha un valore immenso poiché può amplificare il DNA per studi dai minuscoli campioni dei criminali e creare profili di DNA forense. La PCR è ampiamente utilizzata in molte aree della biologia molecolare, tra cui genotipizzazione, clonazione genica, rilevamento di mutazioni, sequenziamento del DNA, microarray di DNA e test di paternità.
Cosa sono i saggi PCR annidati?
Nested PCR è un tipo di PCR che riduce l'amplificazione non specifica del DNA. Ci sono due PCR successive o due reazioni di amplificazione sequenziale nel test PCR annidato. Durante la prima reazione di amplificazione, viene prodotto un prodotto PCR. Dopo la prima reazione, viene eseguita una seconda reazione di amplificazione sul prodotto PCR della prima reazione. Pertanto, i primer nella seconda miscela di reazione si legano al primo prodotto della PCR e lo amplificano.
Figura 02: PCR annidato
Le coppie di primer sono diverse in ciascuna reazione. Il legame non specifico dei primer è ridotto nella PCR nidificata. I saggi PCR annidati sono utili per aumentare la sensibilità e/o la specificità. Tuttavia, la PCR annidata richiede la conoscenza della sequenza interessata.
Cosa sono i saggi PCR in tempo reale?
La PCR in tempo reale o PCR quantitativa (Q PCR) è una versione modificata della PCR che misura quantitativamente i prodotti della PCR. Pertanto, questa tecnica quantifica l'amplificazione in tempo reale utilizzando una macchina PCR in tempo reale. È anche un metodo adatto per determinare la quantità di una sequenza bersaglio o di un gene presente in un campione.
La caratteristica interessante della PCR in tempo reale è che combina sia l'amplificazione che la quantificazione reale in un unico passaggio. Pertanto, la necessità di elettroforesi su gel per il rilevamento può essere eliminata dalla tecnica PCR in tempo reale. L'uso di coloranti fluorescenti per etichettare i prodotti della PCR durante le reazioni della PCR porterà alla fine alla quantificazione diretta. Quando i prodotti della PCR vengono accumulati, vengono accumulati anche i segnali fluorescenti e verranno misurati dalla macchina in tempo reale. SYBR Green e Taqman sono due metodi per rilevare o osservare il processo di amplificazione della PCR in tempo reale. Entrambi i metodi monitorano l'andamento del processo di amplificazione e riportano la quantità del prodotto in tempo reale.
Figura 03: PCR in tempo reale
La PCR in tempo reale ha un'ampia varietà di applicazioni come quantificazione dell'espressione genica, analisi di microRNA e RNA non codificante, genotipizzazione SNP, rilevamento di varianti del numero di copie, rilevamento di mutazioni rare, rilevamento di organismi geneticamente modificati e rilevamento di agenti infettivi.
Quali sono le somiglianze tra i saggi nidificati convenzionali e PCR in tempo reale?
- I saggi PCR nidificati e in tempo reale sono modifiche del saggio PCR convenzionale.
- Tutte e tre le tecniche amplificano i campioni di DNA.
- I loro prodotti possono essere utilizzati nel sequenziamento o nell'analisi.
- Questi test richiedono primer.
Qual è la differenza tra i saggi PCR nidificati convenzionali e quelli PCR in tempo reale?
La PCR convenzionale è una tecnica sviluppata per amplificare specifiche sequenze di DNA. Nel frattempo, Nested PCR è una modifica della PCR convenzionale che consiste in due reazioni di amplificazione sequenziali e la PCR in tempo reale è una variante della PCR convenzionale in grado di quantificare il prodotto amplificato. Quindi, questa è la differenza chiave tra i saggi PCR nidificati convenzionali e quelli in tempo reale. A differenza della PCR convenzionale e in tempo reale, la PCR nidificata utilizza due set di primer. Inoltre, ci sono due successive reazioni di amplificazione nella PCR nidificata al fine di ridurre l'amplificazione non specifica. inoltre, i saggi PCR convenzionali e in tempo reale non contengono due reazioni di amplificazione sequenziale.
La seguente infografica elenca le differenze tra i saggi PCR nidificati convenzionali e quelli PCR in tempo reale in forma tabellare per un confronto affiancato.
Riepilogo – Saggi convenzionali vs nidificati vs PCR in tempo reale
La PCR convenzionale è la prima tecnica sviluppata per amplificare frammenti specifici di DNA. La PCR nidificata e la PCR in tempo reale sono due varianti della PCR convenzionale. Esistono due reazioni di amplificazione sequenziale e l'uso di due set di primer nella PCR nidificata. La PCR in tempo reale è stata sviluppata per quantificare il prodotto PCR amplificato. Pertanto, questo riassume la differenza tra i saggi PCR nidificati convenzionali e in tempo reale.
