PCR vs PCR in tempo reale
La PCR o reazione a catena della polimerasi è una scoperta rivoluzionata nella moderna biologia molecolare, sviluppata per la prima volta dal chimico Kary Mullis nel 1983. Consente di amplificare una singola sequenza in un DNA complesso per l'analisi. L'idea di base della PCR è che due primer, complementari ai filamenti opposti di una sequenza di DNA, siano orientati l'uno verso l' altro; i primer producono filamenti complementari, ciascuno contenente l' altro primer. Quindi, il risultato è una grande quantità di una sequenza corrispondente al DNA che si trova tra i due primer. L'enzima DNA polimerasi viene utilizzato per estendere i primer nella PCR. La DNA polimerasi è un enzima termostabile e ha la capacità di sopravvivere a temperature elevate (da 94 a 95 °C) utilizzate per la denaturazione del DNA stampo.
La PCR prevede tre fasi, vale a dire cicli ripetuti di denaturazione, ricottura dei primer e sintesi del DNA. Una macchina termociclatrice viene utilizzata per eseguire questa reazione in modo che possa essere programmata per modificare le temperature in modo rapido e preciso. Le applicazioni della PCR sono indagini penali, impronte digitali del DNA, rilevamento di agenti patogeni e analisi del DNA delle prime specie umane.
Cos'è la PCR convenzionale?
Ci sono tre fasi principali della PCR convenzionale, vale a dire; Stadio di amplificazione del DNA, separazione della PCR e rilevamento dei prodotti. La separazione dei segmenti di DNA viene in genere eseguita mediante elettroforesi su gel di agarosio. I prodotti vengono quindi colorati con etheiduim bromuro. Infine, il rilevamento si ottiene visualizzando le bande sui gel sotto la luce UV. Pertanto, i risultati finali della PCR convenzionale non sono espressi come numeri. Normalmente la PCR convenzionale è in grado di rilevare solo un singolo parametro.
Cos'è la PCR in tempo reale?
La PCR in tempo reale può rilevare l'amplificazione dei prodotti, poiché i prodotti vengono sintetizzati. Con lo sviluppo della tecnologia, la PCR è diventata una tecnica molto popolare, soprattutto per il rilevamento e l'identificazione di batteri negli alimenti. La PCR in tempo reale utilizza un sistema di tintura fluorescente e un termociclatore dotato di capacità di rilevamento della fluorescenza.
Qual è la differenza tra PCR convenzionale e PCR in tempo reale?
• La PCR convenzionale richiede più tempo poiché utilizza l'elettroforesi su gel per analizzare i prodotti PCR amplificati. Al contrario, la PCR in tempo reale richiede meno tempo in quanto può rilevare amplificazioni durante le prime fasi della reazione.
• La PCR in tempo reale raccoglie i dati nella fase di crescita esponenziale della PCR mentre la PCR tradizionale raccoglie i dati al punto finale della reazione.
• I risultati del punto finale della PCR convenzionale potrebbero non essere molto precisi, ma i risultati della PCR in tempo reale sono molto precisi.
• La PCR in tempo reale è più sensibile della PCR convenzionale.
• La PCR convenzionale ha una risoluzione molto scarsa, mentre la PCR in tempo reale può rilevare pochissime modifiche a causa dell' alta risoluzione.
• Il rilevamento del punto finale della PCR convenzionale ha una gamma dinamica breve mentre il rilevamento della PCR in tempo reale ha un'ampia gamma dinamica.
• A differenza della PCR convenzionale, le tecniche di rilevamento automatico si trovano nella PCR in tempo reale.
• La PCR convenzionale è molto sofisticata e richiede molto più lavoro della PCR in tempo reale.
• A differenza della PCR in tempo reale, la PCR convenzionale non può discriminare tra batteri vivi e morti.
• La PCR in tempo reale utilizza un sistema di coloranti fluorescenti per rilevare i prodotti, mentre la PCR convenzionale utilizza bromuro di etidio e luce UV per visualizzare le bande nel mezzo di gel di agarosio.
