Differenza chiave – Microarray vs RNA Sequencing
Il trascrittoma rappresenta l'intero contenuto di RNA presente in una cellula inclusi mRNA, rRNA, tRNA, RNA degradato e RNA non degradato. La profilazione del trascrittoma è un processo importante per comprendere le informazioni sulle cellule. Esistono diversi metodi avanzati per la profilazione del trascrittoma. Il sequenziamento di microarray e RNA sono due tipi di tecnologie sviluppate per analizzare il trascrittoma. Il differenza fondamentale tra il microarray e il sequenziamento dell'RNA è quello il microarray si basa sul potenziale di ibridazione di sonde etichettate predefinite con sequenze di cDNA target mentre il sequenziamento dell'RNA si basa sul sequenziamento diretto dei filamenti di cDNA mediante tecniche di sequenziamento avanzate come NGS. Il microarray viene eseguito con la conoscenza preliminare delle sequenze e il sequenziamento dell'RNA viene eseguito senza la conoscenza preliminare delle sequenze.
Cos'è il microarray?
Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alto rendimento utilizzato dagli scienziati per la profilazione del trascrittoma. È l'approccio più popolare per l'analisi della trascrizione. È un metodo a basso costo, che dipende dalle sonde di ibridazione.
La tecnica inizia con l'estrazione dell'mRNA dal campione e la costruzione della libreria di cDNA dall'RNA totale. Quindi viene miscelato con sonde predefinite etichettate in modo fluorescente su una superficie solida (matrice spot). Le sequenze complementari si ibridano con le sonde etichettate nel microarray. Quindi il microarray viene lavato e schermato e l'immagine viene quantificata. I dati raccolti dovrebbero essere analizzati per ottenere i profili di espressione relativi.
Si presume che l'intensità delle sonde del microarray sia proporzionale alla quantità di trascrizioni nel campione. Tuttavia, l'accuratezza della tecnica dipende dalle sonde progettate, dalla conoscenza preliminare della sequenza e dall'affinità delle sonde per l'ibridazione. Quindi la tecnologia dei microarray ha dei limiti. La tecnica del microarray non può essere eseguita con trascrizioni a bassa abbondanza. Non riesce a differenziare le isoforme e identificare le varianti genetiche. Poiché questo metodo dipende dall'ibridazione delle sonde, alcuni problemi relativi all'ibridazione come l'ibridazione incrociata, l'ibridazione non specifica ecc. si verificano nella tecnica dei microarray.
Figura 01: Microarray
Cos'è il sequenziamento dell'RNA?
Il sequenziamento del fucile a RNA (RNA seq) è una tecnica di sequenziamento dell'intero trascrittoma recentemente sviluppata. È un metodo rapido e ad alto rendimento per la profilazione del trascrittoma. Quantifica direttamente l'espressione dei geni e si traduce in un'indagine approfondita del trascrittoma. Il sequenziamento dell'RNA non dipende da sonde predefinite o dalla conoscenza preliminare delle sequenze. Pertanto, il metodo RNA seq ha un'elevata sensibilità e capacità di rilevare nuovi geni e varianti genetiche.
Il metodo di sequenziamento dell'RNA viene eseguito attraverso diversi passaggi. L'RNA totale della cellula deve essere isolato e frammentato. Quindi, utilizzando la trascrittasi inversa, è necessario preparare una libreria di cDNA. Ogni filamento di cDNA deve essere legato con adattatori. Quindi i frammenti legati devono essere amplificati e purificati. Infine, utilizzando un metodo NGS, è necessario eseguire il sequenziamento del cDNA.
Figura 02: Sequenziamento dell'RNA
Qual è la differenza tra il sequenziamento di microarray e RNA?
Microarray vs RNA Sequencing |
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| Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alto rendimento. | Il sequenziamento dell'RNA è un metodo accurato e ad alto rendimento. |
| Costo | |
| Questo è un metodo a basso costo. | Questo è un metodo costoso. |
| Analisi di un gran numero di campioni | |
| Ciò facilita l'analisi simultanea di un gran numero di campioni. | Ciò facilita l'analisi di un gran numero di campioni. |
| Analisi dei dati | |
| L'analisi dei dati è complessa. | Più dati vengono generati in questo metodo; quindi, il processo è più complesso. |
| Conoscenza preliminare delle sequenze | |
| Questo metodo si basa su sonde di ibridazione, quindi è richiesta una conoscenza preliminare delle sequenze. | Questo metodo non dipende dalla conoscenza della sequenza precedente. |
| Variazioni strutturali e nuovi geni | |
| Questo metodo non è in grado di rilevare variazioni strutturali e nuovi geni. | Questo metodo può rilevare variazioni strutturali come fusione genica, splicing alternativo e nuovi geni. |
| Sensibilità | |
| Questo non può rilevare differenze nell'espressione delle isoforme, quindi ha una sensibilità limitata. | Questo ha un' alta sensibilità. |
| Risultato | |
| Questo può portare solo a livelli di espressione relativi. Questo non fornisce una quantificazione assoluta dell'espressione genica. | Dà livelli di espressione assoluti e relativi. |
| Rianalisi dei dati | |
| Questo deve essere rieseguito per poter rianalizzare. | I dati del sequenziamento possono essere rianalizzati. |
| Necessità di personale e infrastrutture specifiche | |
| Per il microarray non sono richiesti personale e infrastrutture specifiche. | Infrastrutture e personale specifici richiesti dal sequenziamento dell'RNA. |
| Problemi tecnici | |
| La tecnica del microarray presenta problemi tecnici come l'ibridazione incrociata, l'ibridazione non specifica, il tasso di rilevamento limitato delle singole sonde, ecc. | La tecnica di sequenziamento dell'RNA evita problemi tecnici come l'ibridazione incrociata, l'ibridazione non specifica, il tasso di rilevamento limitato delle singole sonde, ecc. |
| Pregiudizi | |
| Questo è un metodo parziale poiché dipende dall'ibridazione. | Il bias è basso rispetto al microarray. |
Riepilogo – Microarray vs RNA Sequencing
I metodi di sequenziamento di microarray e RNA sono piattaforme ad alto rendimento sviluppate per la profilazione del trascrittoma. Entrambi i metodi producono risultati altamente correlati ai profili di espressione genica. Tuttavia, il sequenziamento dell'RNA presenta vantaggi rispetto ai microarray per l'analisi dell'espressione genica. Il sequenziamento dell'RNA è un metodo più sensibile per il rilevamento di trascrizioni a bassa abbondanza rispetto ai microarray. Il sequenziamento dell'RNA consente anche la differenziazione tra le isoforme e l'identificazione delle varianti geniche. Tuttavia, il microarray è la scelta comune della maggior parte dei ricercatori poiché il sequenziamento dell'RNA è una tecnica nuova e costosa con sfide di archiviazione dei dati e analisi dei dati complesse.
