Differenza chiave – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green e Taqman sono due metodi impiegati per rilevare o osservare il processo di amplificazione della PCR in tempo reale. SYBR Green è un metodo basato sulla colorazione dell'acido nucleico intercalante mentre Taqman è un metodo basato sulla sonda di idrolisi. Entrambe le tecnologie sono progettate per generare fluorescenza durante la PCR, che consente alla macchina PCR in tempo reale di monitorare la reazione in "tempo reale". Il metodo SYBR Green viene eseguito utilizzando un colorante fluorescente chiamato SYBR green e rileva l'amplificazione legando il colorante al DNA a doppio filamento prodotto. Taqman viene eseguito utilizzando sonde a doppia etichetta e rileva l'amplificazione per degradazione della sonda da parte della Taq polimerasi e rilasci del fluoroforo. Questa è la differenza fondamentale tra SYBR Green e Taqman.
Cos'è SYBR Green?
SYBR Il verde è un colorante fluorescente utilizzato per colorare gli acidi nucleici, in particolare il DNA a doppio filamento in biologia molecolare. Il metodo SYBR Green viene utilizzato per quantificare i prodotti della PCR durante la PCR in tempo reale. Una volta che si lega al DNA, il complesso colorante DNA risultante assorbe la luce blu ed emette un'intensa luce verde. Succede a causa del cambiamento strutturale che si verifica nella molecola del colorante quando si lega con il DNA a doppio filamento. Quando la PCR crea sempre più DNA, più molecole di colorante si legano al DNA, generando più fluorescenza. Pertanto, la fluorescenza aumenta con l'accumulo di prodotto della PCR. Pertanto, la quantità di prodotto della PCR può essere misurata quantitativamente mediante il rilevamento della fluorescenza SYBR Green.
Il colorante verde SYBR può essere utilizzato anche per l'etichettatura del DNA in citometria e microscopia a fluorescenza. Il bromuro di etidio è stato sostituito con successo da SYBR Green poiché il bromuro di etidio è un colorante cancerogeno con problemi di sm altimento durante la visualizzazione del DNA nell'elettroforesi su gel.
Ci sono vantaggi e svantaggi del metodo verde SYBR. Questo metodo è molto sensibile, poco costoso e facile da usare. Tuttavia, a causa della sua capacità di legarsi a qualsiasi DNA a doppio filamento, il legame non specifico può portare a una quantificazione eccessiva del prodotto della PCR.
Figura 01: Tecnica SYBR Green
Cos'è Taqman?
Taqman è un metodo alternativo a SYBR Green per monitorare il processo PCR in tempo reale. Questo metodo dipende dall'attività esonucleasica 5'-3' dell'enzima Taq polimerasi per degradare le sonde durante l'estensione del nuovo filamento e il rilascio di fluoroforo. In questo metodo vengono utilizzate sonde a doppia etichetta e si basa sull'idrolisi delle sonde. Le sonde sono oligonucleotidi di DNA marcati in modo fluorescente aventi una molecola reporter fluorescente (fluoroforo) all'estremità 5' e una molecola quencher all'estremità 3'. Sono progettati per legarsi alla dima a filamento singolo sul lato opposto della ricottura del primer. La Taq polimerasi aggiunge nucleotidi al primer ed estende il nuovo filamento verso le sonde a doppia etichetta. Una volta che la Taq polimerasi incontra la sonda, l'azione esonucleasica della Taq polimerasi attiva e degrada la sonda. Una volta completata la sintesi del nuovo filamento, la sonda viene sottoposta a completa degradazione e rilascia il fluoroforo. Il rilascio di fluoroforo genera fluorescenza. La molecola fluorescente Quencher spegne in modo efficiente la luce emessa e crea l'output per la quantificazione del prodotto PCR. Il rilascio di fluorofori e la quantità dei prodotti della PCR sono proporzionali. Quindi, la quantificazione può essere facilmente eseguita con il metodo Taqman.
Figura 02: Metodo Taqman
Il metodo Taqman viene utilizzato in PCR in tempo reale, quantificazione dell'espressione genica, rilevamento di polimorfismi genetici, quantificazione delle delezioni del DNA cromosomico, identificazione batterica, verifica dell'analisi di microarray, genotipizzazione SNP ecc.
Qual è la differenza tra SYBR green e Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
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| SYBR Green si basa sul colorante che lega il DNA. | Taqman dipende dalle sonde di ibridazione e dall'attività esonucleasica da 5' a 3' della Taq polimerasi. |
| Sonde con etichetta fluorescente | |
| Non sono richieste sonde con etichetta fluorescente. | Sono necessarie sonde con doppia etichetta. |
| Analisi genica multiplex | |
| Non può essere utilizzato per target genetici multiplex. | Può essere utilizzato per target genetici multiplex. |
| Costo | |
| Questo è meno costoso. | Questo è più costoso. |
| Specificità | |
| Questo è meno specifico e si lega a qualsiasi DNA a doppio filamento | Questi sono altamente specifici poiché le sonde rilevano i prodotti di amplificazione specifici. |
| Efficacia | |
| Questo è meno efficace. | Questo è molto efficace. |
| Applicazione | |
| Questo viene utilizzato nella PCR in tempo reale, nella visualizzazione del gel di agarosio, nell'etichettatura del DNA ecc. | Questo viene utilizzato in PCR in tempo reale, quantificazione dell'espressione genica, rilevamento di polimorfismi genetici, ecc. |
Riepilogo – SYBR Green e Taqman
Taqman e SYBR green sono due metodi impiegati nella PCR in tempo reale (PCR quantitativa). Entrambi i metodi consentono la quantificazione del prodotto della PCR in modo efficiente e si basano sull'emissione della fluorescenza. Il metodo Taqman utilizza sonde a doppia etichetta per il rilevamento del DNA accumulato mentre il metodo SYBR Green utilizza un colorante fluorescente. Entrambi questi metodi hanno anche diverse applicazioni nella biologia molecolare.
