Differenza chiave – RT PCR vs QPCR
La reazione a catena della polimerasi è una tecnica utilizzata per amplificare una specifica regione del DNA in vitro. Grazie all'invenzione di questa tecnica da parte di Kary Mullis nel 1983, gli scienziati sono in grado di realizzare da migliaia a milioni di copie di frammenti di DNA specifici per scopi di ricerca. Attualmente è diventata una tecnica comune e eseguita di routine nei laboratori clinici e di ricerca per un'ampia varietà di applicazioni. Esistono variazioni della tecnica PCR tradizionale come RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, ecc. RT PCR e Q PCR sono due importanti variazioni della PCR. Il differenza fondamentale tra RT PCR e Q PCR è quello RT PCR viene utilizzato per rilevare l'espressione genica attraverso la creazione di trascritti di DNA complementare (cDNA) dall'RNA mentre Q PCR viene utilizzato per misurare quantitativamente i prodotti PCR in tempo reale utilizzando coloranti fluorescenti.
Cos'è la RT PCR?
La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT PCR) è una variante della PCR utilizzata per rilevare l'espressione dell'RNA. È un metodo molto importante per rilevare l'espressione di mRNA nei tessuti. La RT PCR viene utilizzata quando il materiale di partenza del campione è l'RNA. Nella RT PCR, l'mRNA del modello viene prima convertito in DNA complementare. Questo passaggio è catalizzato dall'enzima trascrittasi inversa e il processo è noto come trascrizione inversa. In secondo luogo, la PCR tradizionale viene utilizzata per il cDNA appena sintetizzato per l'amplificazione.
RT La PCR è una tecnica altamente sensibile che richiede una quantità relativamente piccola di campione di RNA. La RT PCR è comunemente usata nella diagnosi e nella quantificazione delle specie di RNA, in particolare dei virus a RNA come il virus dell'immunodeficienza umana e il virus dell'epatite C.
Figura 01: Tecnica RT PCR
Cos'è QPCR?
La PCR quantitativa (QPCR) è una variante della PCR utilizzata per misurare quantitativamente i prodotti della PCR. Viene anche definita reazione a catena della polimerasi in tempo reale poiché misura l'amplificazione del tempo reale utilizzando la macchina PCR in tempo reale. È un metodo adatto per determinare la quantità di una sequenza bersaglio o di un gene presente in un campione. La caratteristica interessante di QPCR è che combina sia l'amplificazione che la vera quantificazione in un unico passaggio. Pertanto, la necessità di elettroforesi su gel nel rilevamento può essere eliminata dalla tecnica QPCR. QPCR utilizza coloranti fluorescenti per etichettare i prodotti PCR durante le reazioni PCR che alla fine portano alla quantificazione diretta. Quando i prodotti della PCR si accumulano, vengono accumulati anche i segnali fluorescenti e verranno misurati dalla macchina del tempo reale. QPCR può essere combinato con RT PCR. È noto come RT – QPCR o QRT – PCR ed è considerato il metodo più potente, sensibile e quantitativo per il rilevamento dei livelli di RNA nelle cellule o nei tessuti.
SYBR Green e Taqman sono due metodi impiegati per rilevare o osservare il processo di amplificazione della PCR in tempo reale. Il metodo SYBR Green viene eseguito utilizzando un colorante fluorescente chiamato SYBR green e rileva l'amplificazione legando il colorante per produrre DNA a doppio filamento. Taqman viene eseguito utilizzando sonde a doppia etichetta e rileva l'amplificazione per degradazione della sonda da parte della Taq polimerasi e il rilascio del fluoroforo come mostrato in figura 02. Entrambi i metodi monitorano l'andamento del processo di amplificazione e riportano la quantità del prodotto in tempo reale.
La PCR in tempo reale ha un'ampia varietà di applicazioni come quantificazione dell'espressione genica, analisi di microRNA e RNA non codificante, genotipizzazione SNP, rilevamento di varianti del numero di copie, rilevamento di mutazioni rare, rilevamento di organismi geneticamente modificati, rilevamento di agenti infettivi, ecc.
Figura 02: Tecnica PCR quantitativa
Qual è la differenza tra RT PCR e QPCR?
RT PCR vs QPCR |
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| RT PCR è una tecnica utilizzata per rilevare l'espressione genica mediante amplificazione. | QPCR è una tecnica che amplifica il DNA e quantifica i prodotti della PCR in tempo reale. |
| Coinvolgimento dell'enzima trascrittasi inversa | |
| La trascrittasi inversa enzimatica viene utilizzata per la RT PCR. | La trascrittasi inversa enzimatica non viene utilizzata per la QPCR. |
| Uso di molecole etichettate in modo fluorescente | |
| I coloranti o le sonde con etichetta fluorescente non vengono utilizzati per la RT PCR. | Coloranti o sonde con etichetta fluorescente vengono utilizzati per la QPCR. |
| Quantificazione del prodotto PCR | |
| A meno che non sia accoppiato con QPCR, RT PCR non quantifica il prodotto della PCR. | QPCR misura quantitativamente il prodotto della PCR. |
| Materiale di partenza | |
| Il materiale di partenza è l'mRNA. | Il materiale di partenza è il DNA. |
| Sintesi di cDNA | |
| Il DNA complementare viene prodotto durante la RT PCR. | Il DNA complementare non viene prodotto durante la QPCR. |
Riepilogo – RT PCR vs QPCR
RT PCR e QPCR sono due versioni della PCR tradizionale. La tecnica RT PCR viene eseguita per campioni di mRNA ed è guidata dalla trascrizione inversa e dalla produzione di cDNA. QPCR viene utilizzato per quantificare i prodotti della PCR durante i cicli termici della PCR in tempo reale utilizzando coloranti fluorescenti o sonde etichettate. In QPCR, la quantità di prodotto della PCR è rappresentata dai segnali fluorescenti emessi dal campione. RT PCR è comunemente usato come processo di amplificazione mentre QPCR è comunemente usato come processo di quantificazione. Questa è la differenza tra RT PCR e QPCR.
