La differenza fondamentale tra Golden Gate e Gibson Assembly è che Golden Gate si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare, mentre Gibson Assembly non si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza per essere clonato.
Negli ultimi decenni, gli scienziati molecolari hanno sviluppato varie procedure standardizzate che consentono l'assemblaggio più semplice di più frammenti di DNA in un unico pezzo. Pertanto, metodi di clonazione come Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly e TOPO Cloning sono ampiamente utilizzati dai ricercatori negli esperimenti scientifici. Pertanto, Golden Gate e Gibson Assembly sono due metodi di clonazione molecolare che consentono l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo.
Cos'è il Golden Gate Assembly?
Golden Gate è un metodo di clonazione molecolare che facilita l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo. Questo metodo si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare. È nato nel 1996. Questa tecnica utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS e T4 DNA ligasi. Questi enzimi tagliano il DNA al di fuori dei siti di riconoscimento. Possono creare sporgenze non palindromiche. Pertanto, più frammenti di DNA possono essere assemblati utilizzando combinazioni di sequenze sporgenti.
Figura 01: Golden Gate
Procedura di montaggio del Golden Gate
La tecnica Golden Gate ha tre fasi principali nella sua procedura:
- creazione di sporgenze nel vettore di clonazione,
- assemblaggio di più inserti di DNA utilizzando sequenze specifiche per frammenti in sporgenze e
- legatura.
L'assieme Golden Gate utilizza vettori di clonazione circolari (vettore di destinazione). Inoltre, in questo metodo, il sito di restrizione viene eliminato dal prodotto ligato per effettuare la digestione e la legatura contemporaneamente. Un tipico protocollo del ciclo termico per il Golden Gate oscilla tra 37 °C e 16 °C perché 37 °C è ottimale per gli enzimi di restrizione e 16 °C è ottimale per le ligasi.
Cos'è l'Assemblea Gibson?
Gibson Assembly è un metodo di clonazione molecolare che consente l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo. A differenza del metodo Golden Gate, questo metodo non si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare. È stato trovato da Daniel G. Gibson del J. Craig Venter Institute. Questa tecnica è un tipo di metodo di clonazione indipendente dalla sequenza e dalla ligasi (SLIC).
Figura 02: Assemblaggio Gibson
Procedura di assemblaggio Gibson
Il Gibson Assembly necessita di frammenti di DNA contenenti 20-40 coppie di basi sovrapposte a frammenti di DNA adiacenti. Le sovrapposizioni vengono aggiunte tramite PCR. Quindi questi frammenti di DNA vengono aggiunti alla miscela Gibson maser che ha tre enzimi. Questa procedura viene eseguita in condizioni isoterme (50 °C per 1 ora) utilizzando tre diversi enzimi: esonucleasi, DNA polimerasi e DNA ligasi. L'esonucleasi mastica il DNA dall'estremità 5'. Pertanto, non inibisce l'attività della polimerasi e consente alla reazione di procedere in un unico processo. Le regioni a filamento singolo risultanti su frammenti di DNA adiacenti possono essere ricotte a causa delle sequenze di sovrapposizione. La DNA polimerasi riempie le lacune aggiungendo nucleotidi. Infine, la DNA ligasi si unisce in modo covalente al DNA dei segmenti adiacenti. Normalmente, Gibson Assembly utilizza vettori di destinazione linearizzati. Inoltre, questo metodo può combinare simultaneamente fino a 15 frammenti di DNA in base alla somiglianza di sequenza.
Somiglianze tra Golden Gate e Gibson Assembly
- Golden Gate e Gibson Assembly sono due metodi di clonazione molecolare.
- Entrambi i metodi possono assemblare più frammenti di DNA in un unico pezzo.
- Questi metodi utilizzano vettori di destinazione.
- Entrambi i metodi utilizzano termociclatori per l'assemblaggio di più frammenti di DNA.
- Sono usati nella mutagenesi diretta al sito.
Differenza tra Golden Gate e Gibson Assembly
Golden Gate è un metodo di clonazione molecolare utilizzato nell'assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo basandosi sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare, mentre Gibson Assembly è un metodo di clonazione molecolare utilizzato nel assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo senza fare affidamento sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare. Questa è la differenza chiave tra Golden Gate e Gibson Assembly. Inoltre, il metodo Golden Gate utilizza un vettore di destinazione circolare, mentre il metodo Gibson Assembly utilizza un vettore di destinazione linearizzato.
La seguente infografica elenca la differenza tra Golden Gate e Gibson Assembly.
Riepilogo – Golden Gate vs Gibson Assembly
La clonazione molecolare è un metodo utilizzato per assemblare molecole di DNA ricombinante e dirigere la loro replicazione all'interno degli organismi ospiti. Golden Gate e Gibson Assembly sono due metodi di clonazione molecolare che consentono l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un unico pezzo. Il metodo Golden Gate si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare, mentre Gibson Assembly non si basa sulla presenza di siti di restrizione all'interno di una particolare sequenza da clonare. Quindi, questa è la differenza chiave tra Golden Gate e Gibson Assembly.
