Differenza chiave: tripsinizzazione calda e fredda
La tripsinizzazione calda e fredda sono due metodi utilizzati nella disaggregazione enzimatica delle cellule nella coltura di cellule animali. La differenza chiave tra tripsinizzazione calda e fredda, come suggeriscono i nomi, dipende dalla temperatura alla quale viene aggiunta la tripsina per la disaggregazione cellulare. La tripsinizzazione a caldo avviene in condizioni di temperatura più elevata (36,5 – 37 0C) mentre la tripsinizzazione a freddo avviene in condizioni di bassa temperatura.
Durante il processo di coltura cellulare primaria di cellule animali, sono stati utilizzati tre metodi principali che si sono rivelati efficaci. I tre metodi includono la disaggregazione meccanica delle cellule, la disaggregazione enzimatica delle cellule e la tecnica di espianto primario. La disaggregazione enzimatica delle cellule porta all'isolamento delle cellule ed è effettuata dall'enzima tripsina che degrada le proteine. Pertanto, questo processo è noto come tripsinizzazione. La tripsinizzazione può essere eseguita in due diverse condizioni: la tripsinizzazione a caldo e la tripsinizzazione a freddo. La tripsinizzazione a caldo è il metodo per trattare le cellule con tripsina in condizioni calde a una temperatura di 36,5 – 37 0C. La tripsinizzazione a freddo è il processo di trattamento della tripsina che avviene in condizioni più fredde preferibilmente in ghiaccio mantenendo temperature molto basse.
Cos'è la tripsinizzazione calda?
La tripsinizzazione può essere eseguita per disaggregare i componenti cellulari al fine di isolare le cellule per produrre una coltura cellulare primaria. La tripsina è un enzima di degradazione delle proteine e la miscela enzimatica utilizzata nella tripsinizzazione può essere un estratto grezzo o un prodotto purificato. Si dice che l'estratto grezzo sia più efficiente nella lisi proteica e nella disintegrazione cellulare poiché contiene altri enzimi degradativi.
La tripsinizzazione a caldo è il metodo enzimatico più comunemente usato per la disaggregazione cellulare che avviene in condizioni di temperatura più elevata. Prima del trattamento mediante tripsinizzazione, il tessuto desiderato viene tagliato in pezzi più piccoli. Facilita il facile processo di disaggregazione. Il tessuto tritato viene quindi lavato in un mezzo speciale noto come mezzo di sale basale di dissezione.
Al completamento della fase di lavaggio, le cellule vengono trasformate in un pallone contenente l'enzima attivo, che è la tripsina. Poiché questa tecnica implica un protocollo di tripsinizzazione a caldo, la tripsina viene posta a una temperatura di circa 37 0C per circa quattro ore.
Figura 01: Tripsina
Il contenuto viene miscelato e agitato utilizzando metodi di centrifugazione per facilitare il protocollo e accelerare il processo di disaggregazione. Una volta raggiunto il tempo raccomandato, le cellule possono essere derivate dal supernatante. Le cellule derivate dal supernatante vengono quindi incubate a una temperatura e un tempo particolari.
Cos'è la tripsinizzazione a freddo?
La tripsinizzazione a freddo è l' altro tipo di tripsinizzazione che avviene in condizioni di freddo. In questa tecnica, le cellule che vengono tritate e lavate vengono poste in fiale su ghiaccio e quindi imbevute di tripsina. Il periodo di ammollo è molto più lungo – circa 6 – 24 ore.
Dopo il completamento della procedura di ammollo, la tripsina viene rimossa dal lisato cellulare e i pezzi di tessuto vengono ulteriormente incubati a 37 0C per circa 20 – 30 minuti. La disaggregazione delle cellule è determinata dal pipettaggio ripetuto della miscela tissutale. Ciò consentirà alle cellule di dissociarsi dalla membrana e arrivare al surnatante. Una volta che le cellule sono nel supernatante, vengono incubate e fatte crescere alla temperatura e al periodo di tempo desiderati.
Il metodo di tripsinizzazione a freddo ha diversi vantaggi
- Maggiore resa di cellule vitali poiché il danno cellulare è ridotto al minimo. Il danno cellulare è ridotto al minimo non utilizzando le fasi di centrifugazione.
- Metodo estremamente conveniente.
- Meno laborioso.
Il limite principale del metodo di tripsinizzazione a freddo è che grandi quantità non possono essere utilizzate in un solo caso.
Quali sono le somiglianze tra la tripsinizzazione calda e quella fredda?
- Sia i processi di tripsinizzazione a caldo che a freddo utilizzano l'enzima tripsina per la disaggregazione delle cellule.
- I processi di tripsinizzazione a caldo ea freddo vengono utilizzati nelle procedure di coltura cellulare per la disaggregazione delle cellule.
- Nelle procedure di trattamento di tripsinizzazione a caldo ea freddo, le cellule derivano dal supernatante.
Qual è la differenza tra tripsinizzazione calda e fredda?
Tripsinizzazione calda vs fredda |
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| La tripsinizzazione a caldo è il metodo per trattare le cellule con tripsina in condizioni calde a una temperatura di 36,5 – 37 0. | La tripsinizzazione a freddo è il processo di trattamento della tripsina che avviene in condizioni più fredde preferibilmente in ghiaccio mantenendo temperature molto basse. |
| Protocollo | |
| I pezzi di tessuto tagliati vengono mantenuti a 37 0C continuamente durante tutta la procedura. | I pezzi di tessuto tagliati vengono inizialmente mantenuti a temperature ghiacciate e poi mantenuti a 37 0. |
| Temperatura | |
| La calda tripsinizzazione si verifica tra 36,5 e 37 0 | La tripsinizzazione a freddo si verifica a temperature ghiacciate. |
| Tempo consumato | |
| Meno tempo richiesto per l'intero processo (circa 4 ore) di tripsinizzazione a caldo. | Tempo richiesto più lungo (circa 6 – 24 ore) per la tripsinizzazione a freddo. |
| Rendimento di cellule vitali | |
| Basso in calda tripsinizzazione. | Ad alto contenuto di tripsinizzazione a freddo. |
| Uso della centrifugazione | |
| La centrifugazione è necessaria per la disaggregazione delle cellule nella tripsinizzazione a caldo. | La centrifugazione non è richiesta nella tripsinizzazione a freddo. |
| Quantità di tessuto iniziale per tripsinizzazione | |
| Una maggiore quantità di tessuto può essere utilizzata nella tripsinizzazione a caldo. | Una minore quantità di tessuto può essere utilizzata nella tripsinizzazione a freddo. |
| Danno cellulare | |
| Alto dovuto alla centrifugazione durante la tripsinizzazione a caldo. | Meno a causa della tripsinizzazione a freddo. |
Riepilogo – Tripsinizzazione calda vs fredda
La tripsinizzazione è il metodo di utilizzo dell'enzima di degradazione delle proteine tripsina per la disaggregazione e la preparazione delle colture cellulari primarie durante il processo di coltura cellulare. Esistono due tecniche principali di tripsinizzazione in base alle temperature utilizzate durante la procedura. Sono tripsinizzazione calda e fredda. La tripsinizzazione a caldo viene eseguita a 37 0C mentre la tripsinizzazione a freddo viene eseguita in condizioni di ghiaccio. Sebbene la tripsinizzazione a freddo richieda più tempo per il completamento, si dice che abbia una resa maggiore di cellule vitali. Ciò è dovuto al fatto che il danno cellulare è ridotto al minimo nella tripsinizzazione a freddo poiché non utilizza fasi di centrifugazione vigorose. Questa è la differenza tra tripsinizzazione calda e fredda.
