Differenza chiave – Carta vs strato sottile vs cromatografia su colonna
La cromatografia su carta, la cromatografia su strato sottile e la cromatografia su colonna sono tre tipi di tecniche cromatografiche. La differenza fondamentale tra cromatografia su carta, cromatografia su strato sottile e cromatografia su colonna si basa sul tipo di fase stazionaria utilizzata nella tecnica cromatografica. La cromatografia su carta utilizza una carta di cellulosa come fase stazionaria, la cromatografia su strato sottile utilizza allumina o gel di silice come fase stazionaria, mentre la cromatografia su colonna utilizza una colonna impaccata con un materiale di matrice adatto come fase stazionaria.
Nel processo di separazione e identificazione di biomolecole come proteine e carboidrati, la cromatografia è un'importante tecnica biofisica utilizzata. La cromatografia separa i composti in base alla loro solubilità, dimensione e carica. Sulla base del meccanismo di separazione, la cromatografia utilizza meccanismi come lo scambio ionico, l'assorbimento, la partizione e l'esclusione dimensionale e ci sono tre tecniche cromatografiche; vale a dire, cromatografia su carta, strato sottile e colonna. La cromatografia su carta si basa sull'adsorbimento solido-liquido e sulla solubilità del composto e utilizza una carta di cellulosa come fase stazionaria. La cromatografia su strato sottile si basa sull'adsorbimento solido-liquido di molecole. Ha una fase stazionaria che è tipicamente costituita da allumina o gel di silice e la fase mobile che è il solvente. La cromatografia su colonna utilizza una colonna impaccata con una matrice che viene utilizzata per separare le molecole principalmente in base alla loro dimensione, affinità o carica.
Cos'è la cromatografia su carta?
La cromatografia su carta è il tipo più semplice di cromatografia utilizzato e non viene utilizzato per ricerche approfondite. Viene utilizzato principalmente nei laboratori degli studenti per identificare biomolecole come aminoacidi e carboidrati presenti nelle miscele. La cromatografia su carta utilizza una fase stazionaria realizzata con carta di cellulosa o carta da filtro Whatman e una fase mobile che viene solitamente preparata utilizzando solventi organici come n-butanolo, ecc. La fase stazionaria è saturata con acqua, rendendo la fase stazionaria liquida. Pertanto, quando i composti vengono individuati e lasciati correre in presenza della fase mobile, a seconda della solubilità dei composti, vengono separati. Pertanto, dopo lo sviluppo del cromatogramma, è possibile eseguire la colorazione per determinare la corsa e la lunghezza di ciascun composto. In questo modo è possibile calcolare il fattore di ritenzione.
Figura 01: Cromatografia su carta
La cromatografia su carta può essere ulteriormente classificata come cromatografia su carta ascendente e cromatografia su carta discendente a seconda della direzione del solvente in corso.
Cos'è la cromatografia su strato sottile?
La cromatografia su strato sottile o TLC è una tecnica comunemente usata per identificare diversi amminoacidi presenti in una miscela o per identificare le proteine. La tecnica di separazione si basa sull'adsorbimento solido-liquido. Durante la cromatografia su strato sottile, come fase stazionaria viene utilizzata una piastra di allumina o gel di silice. La miscela di solventi varia in base al requisito e può utilizzare diverse combinazioni di composti organici come n-butanolo, acido acetico e acqua per preparare il solvente. I composti da separare vengono macchiati sulla piastra e immersi nella miscela di solventi. Una volta che il solvente sale in base all'azione capillare data dalla piastra, anche i composti macchiati sulla piastra si muovono in base alla loro solubilità nel solvente.
Figura 02: Cromatografia su strato sottile
Il rilevamento delle macchie dopo che il cromatogramma è stato eseguito mediante diverse procedure di colorazione. Alcuni usano la colorazione con ninidrina che è un metodo di colorazione abbastanza tossico. I moderni cromatogrammi a strato sottile utilizzano tecniche di fluorescenza per visualizzare il cromatogramma dopo la corsa. A seconda delle distanze percorse, è possibile calcolare il tempo di ritenzione di ogni composto. Questo può essere utilizzato per identificare il tipo di composto separato in base alla miscela utilizzata. Le TLC vengono utilizzate principalmente per identificare gli amminoacidi in una miscela proteica e anche per separare diversi tipi di monosaccaridi presenti in una miscela.
Cos'è la cromatografia su colonna?
Cromatografia su colonna è un termine ampio utilizzato per descrivere molti tipi di tecniche cromatografiche che utilizzano il metodo di separazione basato su colonna. Nella cromatografia su colonna, una colonna fisica viene utilizzata con un materiale di imballaggio per separare i composti. La separazione può essere basata su diverse proprietà fisiche esibite dai composti. Queste proprietà possono essere la carica, le dimensioni, la conformazione 3D e la capacità di legame, ecc. Pertanto, la colonna impaccata con il materiale della matrice funge da fase stazionaria e il tampone di lavaggio applicato alla colonna funge da fase mobile.
Se le molecole vengono separate in base alle dimensioni, il materiale di imballaggio viene imballato in modo da lasciare i pori attraverso i quali i composti possono viaggiare. Pertanto, le molecole più grandi che non possono fluire attraverso i pori vengono eluite per prime, mentre le molecole più piccole impiegano molto più tempo per eluire.
Figura 03: Cromatografia su colonna
Se le molecole vengono separate in base alla loro carica, la fase stazionaria conterrà uno scambiatore anionico o cationico a cui i composti verranno attratti in base alla loro carica. Pertanto, durante la fase di lavaggio, i composti non legati verranno eluiti. Dopo aver aggiunto il tampone di eluizione, i composti caricati legati verranno eluiti. Il rilevamento di questi eluenti si basa principalmente su tecniche spettrofotometriche.
Quali sono le somiglianze tra carta su strato sottile e cromatografia su colonna?
- Tutta la cromatografia su strato sottile di carta e su colonna vengono utilizzate tre tecniche per la separazione di biomolecole come amminoacidi, proteine e carboidrati.
- Le tecniche di cromatografia su carta su strato sottile e su colonna hanno una fase mobile e una fase stazionaria.
- Le tecniche di cromatografia su carta su strato sottile e su colonna utilizzano meccanismi biofisici per la separazione.
Qual è la differenza tra carta su strato sottile e cromatografia su colonna?
Carta vs strato sottile vs cromatografia su colonna |
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| Cromatografia su carta | La cromatografia su carta è una tecnica cromatografica utilizzata per separare i composti in base all'adsorbimento liquido-liquido e alla solubilità del composto. Utilizza una carta di cellulosa come fase stazionaria. |
| Cromatografia su strato sottile | La cromatografia su strato sottile è un' altra tecnica cromatografica basata sull'adsorbimento solido-liquido di molecole. Ha una fase stazionaria composta da allumina o gel di silice e un solvente come fase mobile, che è il solvente. |
| Cromatografia su colonna | La cromatografia su colonna utilizza una colonna riempita con una matrice che viene utilizzata per separare le molecole principalmente in base alla loro dimensione, affinità o carica. |
| Fase stazionaria | |
| Cromatografia su carta | La carta di nitrocellulosa di Whatman viene utilizzata come fase stazionaria nella cromatografia su carta. |
| Cromatografia su strato sottile | Il gel di allumina o di silice viene utilizzato come fase stazionaria della cromatografia su strato sottile. |
| Cromatografia su colonna | Una colonna impaccata con materiale di imballaggio adatto viene utilizzata come fase stazionaria nella cromatografia su colonna. |
| Fase mobile | |
| Cromatografia su carta | Il solvente in esecuzione è la fase mobile della cromatografia su carta. |
| Cromatografia su strato sottile | Il solvente in esecuzione è la fase mobile della cromatografia su strato sottile. |
| Cromatografia su colonna | Il tampone di lavaggio è la fase mobile della cromatografia su colonna. |
| Meccanismi usati per la separazione | |
| Cromatografia su carta | La cromatografia su carta si basa sull'assorbimento solido-liquido. |
| Cromatografia su strato sottile | La cromatografia su strato sottile si basa sull'assorbimento solido-liquido. |
| Cromatografia su colonna | La cromatografia su colonna si basa sull'esclusione dimensionale, sulla carica e sulla forma. |
| Elution Buffer | |
| Cromatografia su carta | Non richiesto dalla cromatografia su carta. |
| Cromatografia su strato sottile | Non richiesto per cromatografia su strato sottile. |
| Cromatografia su colonna | Richiesto in cromatografia su colonna. |
| Rilevamento | |
| Cromatografia su carta | Colorazione e determinazione del fattore di ritenzione. |
| Cromatografia su strato sottile | Colorazione e determinazione del fattore di ritenzione. |
| Cromatografia su colonna | Determinazione spettrofotometrica. |
Riepilogo – Strato sottile di carta vs cromatografia su colonna
La cromatografia su carta, la cromatografia su colonna e la cromatografia su colonna sono tecniche di separazione utilizzate per separare biomolecole come proteine, amminoacidi e carboidrati (principalmente monosaccaridi). La cromatografia su carta utilizza una carta di cellulosa come fase stazionaria e il meccanismo di separazione si basa sull'adsorbimento solido-liquido. TLC utilizza anche meccanismi di adsorbimento solido-liquido. Le molecole vengono separate nella fase stazionaria, a seconda della loro solubilità nella fase mobile. La cromatografia su colonna utilizza proprietà fisiche come dimensioni, forma, carica e peso molecolare del composto da separare. La colonna impaccata con il materiale della matrice funge da fase stazionaria, mentre il tampone di lavaggio funge da fase solvente. Questa è la differenza tra uno strato sottile di carta e la cromatografia su colonna.
