Differenza chiave – Northern vs Southern vs Western Blotting
Il rilevamento di sequenze specifiche di DNA, RNA e proteine è essenziale per vari tipi di studi in biologia molecolare. L'elettroforesi su gel è una tecnica che separa DNA, RNA e proteine in base alle loro dimensioni. Dai profili del gel, viene rilevata una particolare sequenza di DNA, sequenza di RNA o proteina mediante tecniche speciali chiamate blotting e ibridazione con sonde marcate. Esistono tre diversi tipi di metodi di assorbimento: meridionale, settentrionale e occidentale. La differenza fondamentale tra il blotting del nord del sud e quello dell'ovest risiede nel tipo di molecola che rileva da un campione. Il Southern blotting è un metodo che rileva una specifica sequenza di DNA da un campione di DNA. Il Northern blotting è una tecnica che rileva una specifica sequenza di RNA da un campione di RNA. Il western blotting è un metodo che rileva una specifica proteina da un campione di proteine.
Cos'è il Southern Blotting?
La tecnica del blotting del sud è stata sviluppata da EM Southern nel 1975 per l'identificazione di una specifica sequenza di DNA da un campione di DNA. Questa è la prima tecnica di blotting introdotta in biologia molecolare. Ha consentito il rilevamento di geni specifici dal DNA, frammenti specifici di DNA, ecc. Ci sono diversi passaggi coinvolti nella tecnica del Southern blotting. Sono i seguenti.
- Il DNA viene isolato dal campione e digerito con endonucleasi di restrizione.
- Il campione digerito viene separato mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- I frammenti di DNA nel gel vengono denaturati in singoli filamenti mediante l'uso di una soluzione alcalina.
- Il DNA a filamento singolo viene trasferito su una membrana filtrante di nitrocellulosa mediante trasferimento capillare.
- Il DNA trasferito è fissato permanentemente sulla membrana.
- Il DNA fisso sulla membrana viene ibridato con sonde marcate.
- Il DNA non legato viene lavato via dalla membrana mediante lavaggio.
- La pellicola radiografica viene esposta alla membrana e viene preparata un'autoradiografia.
Il Southern blotting viene applicato per diversi aspetti della biologia molecolare. È utile nella mappatura RFLP, negli studi forensi, nella metilazione del DNA nell'espressione genica, nel rilevamento di geni mutati nei disordini genetici, nel fingerprinting del DNA, ecc.
Figura 01: Tecnica del Southern Blotting
Cos'è il Northern Blotting?
Northern blotting è un metodo progettato per rilevare una specifica sequenza di RNA o sequenza di mRNA da un campione per studiare l'espressione genica. Questa tecnica è stata sviluppata da Alwine, Kemp e Stark nel 1979. Si differenzia dalle tecniche di macchiatura meridionale e occidentale a causa di diversi passaggi. Tuttavia, questa tecnica viene eseguita anche tramite elettroforesi su gel, blotting e ibridazione con sonde e rilevamento specifici etichettati. La tecnica del Northern blotting viene eseguita come segue.
- L'RNA viene estratto dal campione e separato mediante elettroforesi su gel.
- L'RNA viene trasferito dal gel su una membrana assorbente e fissato.
- La membrana viene trattata con una sonda etichettata preparata da cDNA o RNA (la sonda è complementare a una sequenza specifica nel campione).
- La sonda viene incubata con la membrana per legarsi con una sequenza specifica.
- Le sonde non legate vengono lavate via.
- I frammenti ibridati vengono rilevati da un'autoradiografia.
Northern blotting è uno strumento importante per il rilevamento e la quantificazione dell'mRNA ibridato, lo studio della degradazione dell'RNA, la valutazione dell'emivita dell'RNA, il rilevamento dello splicing dell'RNA, lo studio dell'espressione genica, ecc.
Figura 02: Northern Blotting
Cos'è il Western Blotting?
Il Western blotting è un metodo per rilevare una specifica proteina da una miscela proteica mediante l'uso di anticorpi marcati. Pertanto, il western blot è anche noto come immunoblot. Questa tecnica è stata introdotta da Towbin et al nel 1979 e ora viene eseguita di routine nei laboratori per l'analisi delle proteine. I passaggi sono i seguenti.
- Le proteine vengono estratte dal campione
- Le proteine sono separate dalle loro dimensioni mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide
- Le molecole separate vengono trasferite in una membrana in PVDF o in una membrana di nitrocellulosa mediante elettroporazione
- La membrana è bloccata per il legame non specifico con gli anticorpi
- Le proteine trasferite sono legate all'anticorpo primario (anticorpi marcati con l'enzima).
- La membrana viene lavata per rimuovere gli anticorpi primari legati in modo non specifico
- Gli anticorpi legati vengono rilevati aggiungendo un substrato e rilevando il precipitato colorato formato
Il Western blotting è utile per rilevare gli anticorpi anti-HIV in un campione di siero umano. Il Western blot può essere utilizzato anche come test di conferma per l'infezione da epatite B e come test definitivo per la malattia della mucca pazza.
Figura 03: Western Blotting
Qual è la differenza tra il Northern Southern e il Western Blotting?
Nord vs Sud vs Western Blotting |
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| Tipo di molecola rilevata | |
| Northern Blotting | Northern blotting rileva una specifica sequenza di RNA da un campione di RNA. |
| Blotting del sud | Il Southern blotting rileva una specifica sequenza di DNA da un campione di DNA. |
| Western Blotting | Il Western blotting rileva una specifica proteina da un campione di proteine. |
| Tipo di gel | |
| Northern Blotting | Questo utilizza gel di agarosio/formaldeide. |
| Blotting del sud | Questo utilizza un gel di agarosio. |
| Western Blotting | Questo utilizza gel di poliacrilammide. |
| Metodo assorbente | |
| Northern Blotting | Questo è un trasferimento capillare. |
| Blotting del sud | Questo è un trasferimento capillare. |
| Western Blotting | Questo è un trasferimento elettrico. |
| Sonde utilizzate | |
| Northern Blotting | Sonde cDNA o RNA etichettate in modo radioattivo o non radioattivo. |
| Blotting del sud | Le sonde DNA sono etichettate in modo radioattivo o non radioattivo. |
| Western Blotting | Gli anticorpi primari sono usati come sonde. |
| Sistema di rilevamento | |
| Northern Blotting | Questo viene fatto usando un autoradiografia, o il rilevamento di luce o cambiamento di colore. |
| Blotting del sud | Questo viene fatto usando un'autoradiografia, il rilevamento della luce o il cambiamento di colore. |
| Western Blotting | Questo viene fatto utilizzando il rilevamento della luce o il cambiamento di colore. |
Riepilogo – Northern vs Southern vs Western Blotting
Il blotting è una tecnica speciale sviluppata per l'identificazione di DNA, RNA o proteine specifici dai campioni. Esistono tre procedure di blotting separate, vale a dire settentrionale, meridionale e occidentale, per rilevare un tipo specifico di molecola. La tecnica del Northern blotting è progettata per rilevare una specifica sequenza di RNA da una miscela di RNA. La tecnica del Southern blotting consente il rilevamento di una sequenza di DNA specifica da un campione di DNA e la tecnica del western blotting viene sviluppata per identificare una proteina specifica da una miscela proteica.
